Clonación y caracterización del gen que codifica la óxido nítrico sintasa (nos) en la langosta Panulirus argus (Latreille, 1804)relación con el sistema inmune

  1. Rodríguez Ramos, Tania
Dirigida por:
  1. Carlos Pendon Melendez Director
  2. Mario Pablo Estrada García Director/a
  3. Jorge Bolívar Pérez Director

Universidad de defensa: Universidad de Cádiz

Fecha de defensa: 10 de julio de 2012

Tribunal:
  1. Rosa Pérez Gomáriz Presidente/a
  2. María del Carmen Rendón Unceta Secretaria
  3. Ana María Plutín Esteben Vocal
  4. Manuela Ortiz Santesteban Vocal
  5. María Carmen Sarasquete Reiriz Vocal
Departamento:
  1. Biomedicina, Biotecnología y Salud Pública

Tipo: Tesis

Teseo: 327714 DIALNET

Resumen

El óxido nítrico (NO) es un radical libre que está involucrado en una amplia variedad de procesos fisiológicos en los vertebrados e invertebrados, tales como: neuromodulación, contracción muscular y defensa contra patógenos. No obstante, se conoce poco sobre la función de la enzima responsable de la producción de NO, la óxido nítrico sintasa (NOS), en el sistema inmune de los crustáceos. En el presente trabajo se aisló por primera vez el gen que codifica NOS en la langosta espinosa Panulirus argus, y se estudió su relación con la respuesta inmune contra bacterias. A partir de hemocitos de P. argus se obtuvo la secuencia completa de ADNc de NOS mediante RT-PCR y la utilización de oligonucleótidos degenerados. Dicha secuencia tiene 3997 pb con un marco abierto de lectura de 3600 pb y codifica una proteína de 1200 aa con una talla teórica de 136,9 kDa. Se obtuvo que NOS de P. argus (Pa-NOS) contiene los dominios y sitios de unión característicos de las NOS previamente descritas en otros organismos. Se analizó mediante RT-qPCR la expresión del gen en diferentes tejidos y hemocitos, y se demostró una mayor expresión en hemocitos, seguida de corazón y branquias. Adicionalmente, se obtuvo que la expresión del gen y la actividad Pa-NOS aumentan in vitro en hemocitos tras la exposición a lipopolisacáridos (LPS) de Escherichia coli O55:B5, y este incremento también se observó in vivo en branquias y hemocitos, en una forma dosis y tiempo dependiente, lo cual demuestra la naturaleza inducible de la enzima estudiada. Mediante la utilización de herramientas bioinformáticas se predijo la estructura 3D de Pa-NOS lo cual permitió la selección de un fragmento de 666 pb que fue clonado en E. coli para producir un polipéptido recombinante de 31 kDa (Pa 31kDa-NOS), que se utilizó en la generación de un suero anti- Pa 31kDa-NOS en conejos. El suero fue capaz de detectar de forma específica al polipéptido recombinante y a la proteína nativa mediante las técnicas de western blotting e inmunofluorescencia indirecta en langosta. En este trabajo se demuestra por primera vez la localización citoplasmática de NOS en hemocitos de crustáceos. También se demostró el papel crucial de NOS en la defensa contra bacterias en crustáceos mediante un ensayo de inmunoneutralización y reto con Aeromonas hydrophila. La efectividad del suero fue probada en tres especies de crustáceos, lo que lo convierte en una herramienta útil para estudios de localización y función de NOS en este grupo. Este trabajo es una contribución al conocimiento de la estructura de NOS y su participación en la respuesta inmune contra bacterias en crustáceos.