Análisis genético y molecular del operon std de salmonella enterica

Resumo

Salmonella enterica serovar Typhimurium es una bacteria gram-negativa que causa enfermedades gástricas y sistémicas en una gran variedad de organismos, incluyendo la especie humana. La invasión del epitelio intestinal es un proceso crítico en la infección por Salmonella y requiere funciones codificadas en una región del cromosoma bacteriano adquirida por transferencia horizontal, conocida como isla de patogenicidad 1 (SPI-1). Otro locus que Salmonella ha adquirido por transferencia horizontal es el operón std, implicado en la formación de fimbrias que participan en la colonización del intestino del hospedador. La expresión del operón std se encuentra reprimida en condiciones de laboratorio y se activa en el intestino. Estudios previos han mostrado que esta represión es causada principalmente por la metilación Dam y en menor medida por el represor RosE. La transcripción del operón std en los mutantes Dam– requiere HdfR, un factor de transcripción poco conocido de tipo LysR. Estos mismos estudios han sugerido la posibilidad de que la expresión de std esté sujeta a biestabilidad o cambio de fase. Recientemente se ha visto que el producto de los dos genes distales del operón, stdE y stdF, es responsable de la represión de los genes de SPI-1 en mutantes Dam–, que muestran un fenotipo de baja invasión en células epiteliales. En base a estos antecedentes, esta Tesis se inició con el objetivo de investigar si la expresión del operón std está sujeta a biestabilidad en condiciones de laboratorio. La existencia de heterogeneidad fenotípica en poblaciones clonales es un concepto relativamente reciente, pero cada vez son más los ejemplos encontrados. Para determinar si el operón std mostraba biestabilidad se construyeron fusiones GFP en stdA y se usó citometría de flujo para analizar su expresión en células individuales. De estos experimentos se ha podido concluir que existe una expresión bimodal del operón std en condiciones de laboratorio. La expresión de std tiene lugar en un 0,3-3% de la población, generando dos subpoblaciones: StdON y StdOFF. Otro objetivo de esta Tesis era entender el mecanismo molecular que controla la transcripción de std generando una expresión bimodal del mismo. Se ha puesto de manifiesto el papel esencial de HdfR para la expresión de std, no solo en fondo Dam– como ya se había descrito sino también en fondo silvestre. La subpoblación StdON desaparece en ausencia de HdfR y aumenta de tamaño si hdfR se expresa constitutivamente. Además, igual que ocurre en otros factores transcripcionales de tipo LysR, hemos demostrado la existencia de un proceso de autorregulación (represión) que mantiene la transcripción de hdfR en niveles constantes. La metilación Dam es el principal represor de la expresión del operón std, pero existen otros represores previamente descritos como RosE o SeqA. En colaboración con el grupo de la Dr. Delgado del Instituto Superior de Investigaciones Biológicas (INSIBIO) CONICET-UNT en Argentina, se ha identificado un nuevo represor de la expresión de std, RcsB. La expresión constitutiva de rcsB reprime la expresión de std en fondo Dam– y también en fondo silvestre. Se han realizado ensayos de retardo en gel para corroborar la unión de RcsB a la región promotora de std. El análisis bioinformático identifica un posible sitio de unión de RcsB en la región -35 del promotor de std. Con el fin de identificar otros posibles reguladores de la transcripción del operón std, se realizaron escrutinios genéticos. Los resultados obtenidos mostraron una autorregulación positiva del operón std, de la que son responsables los genes distales del operón std: stdE y stdF. Ensayos realizados mediante citometría de flujo corroboran los resultados del escrutinio. La expresión de stdE y stdF mantiene la subpoblación StdON y una expresión constitutiva de stdE y stdF aumenta el tamaño de dicha subpoblación. La expresión bimodal del operón std en fondo silvestre nos llevó a pensar en la existencia de patrones de metilación distintos para cada una de las subpoblaciones. Para demostrar la existencia de dichos patrones de metilación se han realizados ensayos de Southern Blot tras digestión del DNA con isosquizómeros de enzimas de restricción que reconocen la misma secuencia en el DNA (GATC) pero difieren en su sensibilidad al estado de metilación de la diana. Los tres sitios GATC de la región reguladora se hallan metilados cuando el promotor está inactivo (la subpoblación StdOFF es mayoritaria en un fondo silvestre). Resultados de citometría de flujo sugieren un patrón de metilación distinto para la subpoblación StdON, ya que la hipermetilación disminuye dicha subpoblación. Anteriormente se había descrito que StdE y StdF controlan la expresión de hilD a nivel postranscripcional. Teniendo en cuenta que nuestros resultados indican que StdE y StdF son reguladores autógenos de la transcripción de std, nos planteamos la posibilidad de que estas proteínas tuvieran un papel regulador. Con objeto de identificar posibles dianas de regulación del regulón StdEF se realizó un análisis transcriptómico usando un microarray de S. enterica serovar Typhimurium. Los datos obtenidos nos han permitido identificar a StdE y StdF como reguladores globales de la transcripción en Salmonella, ya que no sólo reprimen la isla de patogenicidad 1 (SPI-1) sino también genes flagelares y de quimiotaxis. Por otra parte, StdEy StdF activan la expresión de genes del plásmido de virulencia y del gen hdfR, que codifica el factor de transcripción esencial para la expresión del operón std. Para tratar de determinar el mecanismo regulador de estas proteínas, hemos realizado un ensayo de ChIP-seq (inmunoprecipitación de cromatina seguida de secuenciación masiva), que permite identificar sitios de unión al DNA de las proteínas analizadas. Los resultados obtenidos confirman el papel de StdE y StdF como reguladores transcripcionales de la expresión en Salmonella. StdE parece tener un papel principal, uniéndose a regiones promotoras del DNA. Por otro lado, los resultados del ChIP-seq sugieren un papel secundario o accesorio de StdF en la regulación, quizá favoreciendo la actuación de StdE. El análisis global de la unión de StdE y StdF al genoma de Salmonella ha proporcionado información acerca de la autorregulación del operón std. Como ya se ha mencionado, StdE y StdF favorecen la expresión de std, aumentando el tamaño de la subpoblación StdON. Según los datos del ChIP-seq, es StdF quien se encuentra en la región promotora, favoreciendo la expresión de std. Queda por determinar si StdF tiene un papel principal en la regulación de std o, como en otros sitios de regulación, actúa de modo auxiliar, tal vez favoreciendo la unión de HdfR o impidiendo la actividad de la metilasa Dam. Todo parece indicar que nos encontramos frente a un sistema de regulación global pero con expresión bimodal. La expresión del operón std, con la consiguiente formación de fimbrias, tiene lugar en una pequeña fracción de la población en condiciones de laboratorio, y mayoritariamente en condiciones de adherencia al epitelio intestinal. En dichas condiciones, la bacteria mantiene reprimidos los genes implicados en virulencia, expresión del flagelo o quimiotaxis, y los genes reguladores del operón std son los encargados de coordinar estos procesos. Por otro lado la expresión del operón std favorece la activación del sistema conjugativo del plásmido de virulencia y garantiza el mantenimiento del mecanismo autorregulador de expresión del propio operón std al activar el factor de transcripción HdfR y al ejercer de reguladores transcripcionales uniéndose a la región promotora del propio operón std.