Cation-mediated interaction between dna and anionic lipid surfacesexperimental and simulation study

  1. Luque Caballero, Germán
Supervised by:
  1. Alberto Martín Molina Director
  2. Victor Manuel Quesada Perez Director
  3. Julia Maldonado Valderrama Director

Defence university: Universidad de Granada

Fecha de defensa: 24 July 2014

Committee:
  1. Miguel Ángel Cabrerizo Vílchez Chair
  2. Ana Belén Jódar Reyes Secretary
  3. M. Carmen Morán Badenas Committee member
  4. Alberto Antonio Caria Canelas Pais Committee member
  5. Elena Junquera González Committee member

Type: Thesis

Abstract

RESUMEN El objeto de este estudio es la interacción entre polianiones y membranas cargadas negativamente mediada por cationes multivalentes. Este fenómeno se pone de manifiesto en la formación de lipoplejos aniónicos, que son agregados mesoscópicos formados a partir de liposomas con carga negativa y polinucleótidos en presencia de cationes multivalentes. El interés en este tipo de sistemas se debe a su capacidad para transportar material genético al interior celular, permitiendo el acceso a una diana terapéutica a nivel molecular. Su principal ventaja frente a otro tipo de vectores usados en terapia génica es que, al estar formados por lípidos presentes en la membrana celular, su toxicidad es mucho menor. La investigación básica que nos planteamos con este proyecto sobre la naturaleza de las interacciones presentes en los lipoplejos aniónicos es esencial para comprender los mecanismos responsables de su formación, estabilidad y función. Así, en el presente trabajo realizamos una caracterización del sistema membrana-catión-polianión combinando enfoques experimentales y teóricos. El manuscrito comienza con una introducción donde se resume el estado del arte de la biofísica de lipoplejos aniónicos. En primer lugar, se recopilan los resultados relacionados con la estructura y función de una variedad de sistemas preparados en disolución. Seguidamente, presentamos el estudio de la complejación en la interfase aire-agua como un modelo experimental para indagar en la influencia de otros factores como el empaquetamiento lateral. Finalmente, describimos la aplicación de modelos teóricos para predecir los factores que gobiernan la formación y la estructura de este tipo de complejos. Más adelante, planteamos los objetivos del proyecto de investigación de acuerdo a los enfoques mencionados en la introducción. En la sección de metodología, detallamos los protocolos experimentales y de simulación empleados. En particular, la deposición de películas por el método de Langmuir-Blodgett y la visualización por microscopía de fuerzas atómicas de las estructuras presentes en la interfase se ha puesto a punto en nuestro laboratorio. Las medidas de espectroscopía de reflexión-absorción de infrarrojo se realizaron durante una estancia de formación en el Instituto Max Planck de Coloides e Interfases en Potsdam (Alemania). También se ha desarrollado el código fuente de los programas utilizados para llevar a cabo las simulaciones computacionales sobre modelos de grano grueso. Las medidas de espectroscopía de fluorescencia se realizaron a través de una colaboración en los laboratorios del Departamento de Química-Física de la Universidad de Granada. A continuación, discutimos ampliamente los resultados obtenidos, y las publicaciones a las que han dado lugar se recogen en un anexo. La presentación de los resultados se organiza en función de la estrategia utilizada para estudiar la complejación. Primero, presentamos los resultados procedentes de la caracterización de la interacción en la interfase aire-disolución, visualizando las estructuras resultantes e identificando los grupos funcionales implicados; después, evaluamos la capacidad de encapsulamiento de ADN en disolución y por último, mostramos los resultados del estudio teórico sobre el papel de las interacciones electrostáticas en la formación y estabilidad de los complejos. Finalmente, enunciamos las conclusiones en función de los resultados del trabajo. Así, hemos demostrado que interacciones de distinta naturaleza concurren en la formación de los lipoplejos aniónicos. En particular, los efectos superficiales derivados del empaquetamiento lateral modulan la morfología de las estructuras que se forman en la interfase, mientras que las interacciones electrostáticas afectan de manera decisiva a la estabilidad de los complejos. Tras valorar el trabajo realizado, consideramos que a partir del conocimiento adquirido en esta investigación es necesaria una caracterización más amplia, profundizando en los enfoques escogidos en combinación con otras estrategias, permitiendo desentrañar el conjunto de interacciones que intervienen en estos sistemas complejos. La comprensión de aspectos básicos de la formación, estabilidad y función de los lipoplejos aniónicos será de gran ayuda para el diseño de fórmulas optimizadas para prestaciones biomédicas.