Análisis bioquímico y bioinformático aplicado a la proteína itih4 en patología del s.n.c. y leucemias resistentes a la apoptosis

Resumen

En nuestro laboratorio se identificó una nueva proteína de fase aguda en el cerdo, la Major Acute-phase Protein, Pig-MAP, a finales de los 90 y desde entonces se viene trabajando para elucidar su función. Esta proteína forma parte de una familia de inhibidores de proteasas característica del suero sanguíneo humano. Por consenso, se la ha nombrado como la nueva cadena pesada H4 de la familia ITI (ITIH4). En el contexto de dos acciones concertadas y un proyecto europeo, nuestro laboratorio ha estudiado la respuesta de ITIH4 y otras proteínas de fase aguda (PFA) como haptoglobina, proteína C-reactiva, APO A-1, en modelos animales (porcino y bovino) y en situaciones fisio-patológicas (infecciones víricas y bacterianas, estrés, entre otras). Tanto la regulación de la expresión de la ITIH4 como de la haptoglobina, depende de la IL-6 en el hígado, lugar donde se sintetizan. La respuesta a la agresión (infección, inflamación...) de las PFA varía según la especie. Por ejemplo, la ITIH4 muestra cambios significativos en porcino y moderados en bovino. En la especie humana, su concentración sérica en pacientes con infarto agudo de miocardio, sólo aumenta 2 veces su concentración. Esta proteína también muestra grandes variaciones en cuanto a estabilidad dependiendo de la especie, siendo la más estable la proteína de origen porcino. En el caso de la proteína humana se ha descrito la generación de fragmentos derivados de ITIH4 por acción de calicreínas in vitro. En el suero de pacientes con diferentes tipos y estadios de cáncer, se han detectado péptidos derivados de ITIH4 generados por la acción de proteasas tumorales. Además, resultados recientes de este laboratorio, presentados en la Tesis Doctoral de la Dra. Idoia Alonso (Diciembre 2009), confirman esta proteolisis asociada a fenotipo tumoral in vitro, en células de MCF-7 y Jurkat. Por otra parte, otra de las líneas de investigación de nuestro grupo de trabajo es la caracterización de las sublíneas leucémicas de fenotipo altamente proliferativo y resistentes a apoptosis (Jhp y Jws) que se generaron en nuestro laboratorio a partir de las células de la leucemia humana tipo T Jurkat en el año 1996 (Martinez-Lorenzo 1996). Desde entonces han sido utilizadas para estudiar diferentes mecanismos de apoptosis inducidos por drogas. Con estos antecedentes, en el presente trabajo, se han abordado dos líneas generales de actuación que han discurrido de manera interrumpida en el tiempo de la investigación: I. Por un lado, el estudio de la proteína de fase aguda ITIH4 en sueros normales y procedentes de patologías del SNC (HCUMS, Zaragoza), para lo cual ha sido necesario la purificación de la proteína y de reactivos específicos (antisueros y anticuerpos) para poder conocer la concentración de ITIH4 en suero por análisis inmunoquímicos; así como el estudio molecular para la obtención de las construcciones (vector pTargeT-ITIH4) encaminadas a la transfección posterior de líneas celulares tumorales en cultivo (COS, HEK293T, entre otras) y poder obtener proteína en cantidades suficientes para abordar en un futuro estudios estructurales (se han realizado pruebas preliminares de cristalización de la proteína) así como la obtención de las Jurkat parentales y de las sublíneas derivadas transfectadas con ITIH4 de forma permanente (o de momento, de forma transitoria) para abordar los estudios de apoptosis, y finalmente, se ha realizado un análisis bioinformático de uno de sus dominios (von Willebrand) en relación con su posible interacción con proteínas del Complemento. II. Para la caracterización de las sublíneas hiperproliferativas, se ha generado una herramienta informática Leucochip v2.0, que organiza el análisis de la expresión génica diferencial obtenida en base a un array comparativo con las Jurkat parentales y además, se ha realizado el análisis bioquímico de la bionergética y, de su relación con la apoptosis de estas sublíneas en relación con las parentales. En el apartado siguiente de CONCLUSIONES, se recogen las principales aportaciones obtenidas en ambas líneas de actuación. Como en todo trabajo por investigación, es mucho el camino que se recorre, pero lo es más el que queda por recorrer. Por esta razón, a continuación, se hace referencia a las líneas de trabajo futuras que se han delineado en parte, en el apartado anterior, que servirían para la continuación de esta Tesis Doctoral y que tendrían como objetivo principal el estudio de la interacción de ITIH4 y otras PFA con células tumorales en cultivo. Para ello, se utilizarán diversas aproximaciones experimentales. Dado que se dispone de la experiencia previa en el estudio de la apoptosis y su relación con la bioenergética en las células Jurkat, Jhp y Jws, y en el presente trabajo se han fijado las condiciones para realizar transfecciones transitorias con la proteína, se realizarán dichas transfecciones y se estudiará cómo afecta la sobreexpresión de la ITIH4 a los mecanismos de apoptosis en estas células. Estas líneas celulares se han elegido por su capacidad de producir proteasas funcionales, susceptibles de degradar la ITIH4 y posiblemente otras PFA. De este modo, se pretende también analizar el posible papel de los fragmentos de las proteínas en la regulación de la apoptosis y sobre la bioenergética celular. A pesar de los estudios que se han realizado por nuestro grupo y por otros, de momento, poco se sabe acerca de su función de esta proteína. Se ha descrito que la ITIH4 puede producir inhibiciones en la acción de células inflamatorias y puede tener un papel relevante durante la regeneración de células hepáticas. Además, en un trabajo realizado en colaboración con la Dra. Sylvie Blond (Center for Pharmacelutical Biotechnoly, University of Illinois at Chicago, USA) se describe la existencia de interacciones estables de la ITIH4 con una chaperona, la HTJ1, proteína del Retículo Plasmático, hómologa a la humana, MTJ1/ERDJ1. Esta unión podría proteger a la ITIH4 de la acción de proteasas como la calicreína. Por otra parte, el estudio del gen de la ITIH4 revela la existencia en la proteína de tres dominios: i) un dominio VIT en el extremo N-terminal, que se encuentra en las ribonucleoproteínas de los complejos Vault que están implicados en translocaciones entre el núcleo y el citoplasma y se sobrexpresa en tumores resisitentes a tratamiento con fármacos, ii) un dominio central von Willebrand de tipo A, presente en proteínas relacionadas con la adhesión celular como son los receptores de integrinas, en factores del complemento y en inhibidores de proteasas y, iii) un tercer dominio correspondiente a la cadena pesada de la familia de las ITI en el extremo C-terminal. Si consideramos que, en conjunto ó alguno de estos dominios estructurales, la localización celular de la ITIH4 y la interacción de la proteína con otros factores proteícos, pueden estar relacionados con la función de esta proteína, se abordarán diferentes estrategias experimentales para su estudio. Estas estrategias consistirán principalmente en transfecciones celulares con construcciones de la proteína, adición de la proteína entera o fragmentos de ella, inmunoprecipitaciones, y estudios de apoptosis celular, entre otras. Los resultados que se obtengan permitirán avanzar en la comprensión de los mecanismos biológicos en los que participa la proteína ITIH4 en células neoplásicas en comparación con células normales o de baja malignidad.