Variabilidad genética de las poblaciones salvajes y cultivadas de sargo común (diplodus sargus linnaeus,1758). Caracterización de los factores de crecimiento similares a la insulina (igf-i e igf-ii)

Resumen

El sargo (Diplodus sargus) es una especie de interés comercial susceptible de ser criada en cautividad favoreciendo la diversificación de especies requerido por el sector. Sin embargo, todavía existe poca información sobre su fisiología, nutrición y genética que permita avanzar en la acuicultura de esta especie. Esta tesis tiene como objetivo general el desarrollo herramientas moleculares para la gestión genética de reproductores y la caracterización de los factores de crecimiento similares a la insulina (IGF-I e IGF-II) y su implicación en múltiples funciones de interés productivo como desarrollo, osmorregulación, reproducción y alimentación. Para la gestión genética, se han aislado y caracterizado marcadores moleculares mitocondriales (citocromo b y región de control) y nucleares (8 loci microsatélites). Dichos marcadores se han aplicado al estudio de poblaciones salvajes de la costa de Andalucía (Atlántico y Mediterráneo) y cultivadas (F1 criada en cautividad). Los datos de ambos tipos de marcadores fueron congruentes demostrando la existencia de una población salvaje panmíctica. Además, se pudo determinar una pérdida significativa de variabilidad genética de la población cultivada probablemente asociada a un efecto cuello de botella por éxito reproductivo. Respecto a la caracterización de las IGFs, se han aislado los cDNAs que codifican para ambas IGFs con un tamaño de 1255 y 1666 nucleótidos para la IGF-I e IGF-II, respectivamente. En ambos casos se identificaron los dominios conservados B, C, A, D y E y las cisteínas que le confieren funcionalidad. Para estudiar su estructura genómica, se diseñaron cebadores específicos en los exones y se amplificaron y secuenciaron por paseo cromosómico. El gen IGF-I poseía 5 exones y 4 intrones. Además, se identificó un procesamiento alternativo de los exones 3 y 4 que originaba tres transcritos diferentes (denominados IGF-Ia, IGFI-b e IGFI-c). El gen IGF II presentó 4 exones y 3 intrones y no se observaron posibles procesamientos alternativos. Además para la IGF-I se ha caracterizado su promotor mediante PCR inversa, e identificado numerosos elementos reguladores (caja TATA, iniciador y sitios de unión de factores de transcripción como HNF y C/EBP). Los estudios de expresión de ambas IGFs durante el desarrollo embrionario y larvario demostraron mayores niveles de transcritos de IGF-II en las primeras etapas embrionarias y de IGF-I en estadíos más tardíos del desarrollo larvario. En órganos de juveniles, el hígado fue el principal órgano de expresión de IGF-I, mientras que IGF-II se expresaba de forma ubicua y al mismo nivel en todos los órganos estudiados. Experimentos de inducción mediante inyección con GH mostraron que ambas IGFs incrementaban de forma temprana (30 minutos tras administración de la hormona) sus transcritos en hígado (2,3 y 3,8 veces para IGF-I e IGF-II, respectivamente) y branquia (2,9 y 2,3 veces para IGF-I e IGF-II, repectivamente). Para evaluar el papel de las IGFs en la osmoregulación, se expusieron peces a tres salinidades diferentes (15, 37 y 50 ppt durante 4 días). El cambio de salinidad de 37 ppt a 50 ppt y 15 ppt no produjo cambios significativos en la expresión de IGFs en hígado. Solamente, la hipersalinidad (50 ppt) incrementó los niveles de ARNm de IGF-I e IGF-II en branquias a las 8 horas tras el cambio de salinidad. Respecto al efecto de la alimentación sobre la expresión de IGFs, el ayuno prolongado (4 semanas) redujo drásticamente los niveles de transcritos de ambas IGFs. La realimentación utilizando tres dietas diferentes (2 piensos comerciales y camarón) incrementó progresivamente los niveles de ARNm de IGF-I en hígado observándose un máximo a la 3ª semana (3,1 veces en animales alimentados con camarón). No se observaron diferencias significativas entre las dietas ensayadas. Por el contrario, la transcripción de IGF-II se indujo más temprano (1ª semana) en el hígado de animales alimentados con camarones. Estos datos indican que la expresión de las IGFs está modulada por la salinidad y la dieta sugiriend un posible papel en su regulación. Para estudiar la relación entre la madurez gonadal y la expresión de IGFs se cuantificó la expresión de IGF-I e IGF-II en gónadas masculinas y femeninas de D. sargus, cuyo grado de madurez se determinó previamente mediante técnicas histológicas. En machos, los transcritos de IGF-I aumentaron en peces espermiantes (2,6 veces). En hembras, los ARNm de IGF-I se incrementaron en hembras maduras en puesta (9,5 veces) mientras que los niveles de transcrito de IGF-II fueron superiores en estadíos inmaduros (S1-S2) (7,5 veces). Para determinar una posible regulación transcripcional en gónadas por la GH y hormona liberadora de gonadotropinas (GnRH), los peces se inocularon con estas hormonas por vía intraperitoneal observando un aumento de los ARNm de IGF-I e IGF-II a las 48 y 24 horas, respectivamente, tras la inoculación de GH y de los los transcritos de ambos genes a las 24 horas tras la inyección de GnRH. Estos resultados sugieren un papel de IGF-I en el mecanismo de maduración de la gónada y que ambos genes podrían actuar como mediadores directos o indirectos de las acciones de GH y GnRH en testículos y ovarios de D. sargus