Evaluación de los métodos de genotipado del virus de la hepatitis C y detección del polimorfismo q80k del gen ns3 para pacientes naïve a los nuevos antivirales de acción directa

Resumen

Desde el año 2012 en que se aprueban los primeros Antivirales de Acción Directa (AADs), el tratamiento de la hepatitis C (VHC) ha experimentado un cambio histórico y se está viviendo un momento muy esperanzador para erradicar esta enfermedad. Los resultados de los ensayos clínicos realizados con estos nuevos tratamientos alcanzan tasas de respuestas virales del 90 al 100% dependiendo de la combinación del fármaco y del genotipo del virus de la hepatitis C (VHC). Y esto es así, las guías nacionales e internacionales (AASLD/IDSA., 2015) (EASL, 2015) (GEHEP 2015) nos van a recomendar emplear una u otra combinación de AADs según la condición clínica del paciente (en especial grado de fibrosis), y según el genotipo del VHC. Desde luego hay mas variables que manejar en la consulta clínica como puede ser la valoración clínica de las manifestaciones extrahepáticas, grado de replicación del virus, necesidad de trasplante, embarazo y un largo etc¿. En este trabajo de tesis uno de los aspectos en los que hemos incidido ha sido la importancia de la correcta determinación del genotipo del VHC. Existen varios ensayos comerciales con marcado CE para determinar el genotipo del VHC, todos ellos se basan en amplificar regiones conservadas del genoma del VHC, como pueden ser 5`-UTR, core y NS5B. La mayoría de los ensayos van dirigidos frente a las 2 primeras regiones ya que al ser mas conservadas aseguran una mayor sensibilidad a la hora de amplificar las muestras. Pero hay que añadir que al ser regiones mas conservadas se discrimina mal entre algunos genotipos y subtipos. En cambio NS5B es una región mucho más variable dentro del genoma del VHC y cabe esperar que discrimine mejor los genotipos. De hecho, así ocurre y actualmente se considera la secuenciación de este gen y el análisis filogenetico posterior como la técnica de referencia para genotipar el VHC (Simmonds P B. J., 2005) (Murphy DG, 2007) (Tong, 2015). En 2013 el ¿International Committee for Taxonomy of Viruses (ICTV)¿, el cual se encarga de mantener y actualizar periódicamente las paneles de las cepas de referencia, revisar o proponer nuevos genotipos o subtipos de VHC entre otros cometidos nos recuerda que para asignar nuevos genotipos se requiere de al menos la secuenciación completa de 1 o mas regiones codificadoras, además de otra serie de cumplimientos (Smith DB, 2014), lo cual llama la atención que estemos empleando una región que ni siquiera se contempla en los grupos de estudio de Taxonomía del VHC. La siguiente pregunta que se nos planteaba era averiguar qué grado de concordancia había entre los diferentes ensayos comerciales y la secuenciación de NS5b. Si encontráramos que no existiera mucha discordancia no haría falta realizar una técnica casera de secuenciación y así se podían emplear los ensayos con marcado CE. Para evaluar este aspecto se seleccionaron las siguientes técnicas por ser las mas empleadas: Trugene HCV genotyping kit (Siemens), VERSANT HCV Genotype 2.0 assay (Siemens), y Real Time HCV genotype II (Abbott), y se reclutaron varios laboratorios de diferentes provincias de España: Hospital Conxo-CHUS Santiago de Compostela, Hospital Ramón y Cajal de Madrid, Clínica Universidad de Navarra, Pamplona y Hospital de la Princesa de Madrid. Gracias a un proyecto que concedió el grupo de estudio de las hepatitis víricas (GEHEP) de la SEIMC (Proyecto GEHEP-007) pudo financiarse el estudio y fruto del trabajo ha sido implantar y recomendar como nueva tecnología para la determinación del genotipado del VHC en el laboratorio de rutina asistencial el empleo de la secuecnciación de NS5B. De los resultados obtenidos se encontró una discordancia total del 34% (exactitud del 66%) para el ensayo de Trugene y del 18% para VERSANT HCV2.0 (exactitud del 82%). El ensayo Abbott identificó correctamente todos los subtipos 1a y 1b y los genotipos 2, 3, 4 y 5, pero no era capaz de discriminar el subtipo de los genotipos 2, 3, 4 y 5. Las principales discordancias que se encontraron en el ensayo de Trugene VHC fue clasificar mal el genotipo 1b (n = 14). 13 de los 14 casos se reclasificaron como 1a mediante secuenciación de ADN NS5B, y 1 caso reclasificados como 3a; además, 5 casos mal clasificados como 1a por Trugene se reclasificaron como 1b mediante secuenciación la técnica de referencia. Respecto a VERSANT HCV 2.0, encontramos discordancias importantes en el 9% de los casos, siendo, todos excepto uno (n = 8) debidos a una clasificación errónea del genotipo 1b que fueron posteriormente reclasificados como 1a por el método de referencia; el otro caso registrado fue clasificando erróneamente un genotipo 1 que fue reclasificado como 4d por secuenciación del ADN NS5B. Existen discordancias mayores y menores entre los diferentes ensayos empleados en el genotipado de VHC, el ensayo Trugene, sobre todo, y el Versant HCV 2.0, en menor medida, puede fallar para diferenciar genotipos del VHC. En virtud de las discordancias observadas, recomendamos implantar la secuenciación de la región NS5B en la rutina asistencial. En este trabajo también hemos abordado el estudio de la prevalencia de ciertos polimorfismos, que se ha demostrado que tienen un claro impacto sobre la respuesta al tratamiento. Atendiendo a los resultados de los ensayos con los nuevos tratamientos que se iban aprobando, se empezó a describir un polimorfismo en NS3, el polimorfismo Q80K, que claramente disminuía la tasa de respuesta viral sostenida en los pacientes de genotipo 1a que se trataban con Simeprevir+pegIFN+RVB. De hecho, en la nuevas guías que iban apareciendo en el año 2014, con las nuevas pautas de tratamiento, se hacía referencia a la necesidad de detectar este polimorfismo en los pacientes con genotipo 1a que iniciarían tratamiento con esta combinación. Puesto que era el único cambio que se recomendaba estudiar y con la idea de implementar una técnica mas sencilla y rápida nace el segundo estudio de esta tesis, cuyo objetivo pasó a ser el desarrollo de una PCR alelo específica (PCR-AE) para la detección del polimorfismo Q80K. Poder desarrollar esta técnica se nos planteaba como un gran desafío debido a la naturaleza del VHC ya que este virus presenta una gran variabilidad en su secuencia. Podemos decir que hemos logrado desarrollar esta metodología y actualmente se encuentra protegida con una patente de invención, (ver Anexo 2) y que además ha servido para poner a punto la determinación del polimorfismo Q80K la cual ha quedado incorporada a la cartera del Servicio de Microbiología del Hospital Universitario San Cecilio de Granada para los pacientes remitidos por los servicios de Digestivo e Infecciosas de gran parte de la geografía nacional. Finalmente constatamos que existían pocos estudios que dieran datos sobre la prevalencia del polimorfismo Q80K en nuestro entorno. Se conocía de la alta prevalencia en EEUU y empezaban a aparecer datos sobre países como Francia y Suecia, pero se desconocía el valor numérico en España. Por tanto aprovechando la nueva tecnología implantada en nuestro laboratorio se calculó la prevalencia de polimorfismo Q80K para genotipo 1a, la cual hemos estimado en el 9,6%. Existen grandes diferencias de prevalencia del polimorfismo Q80K dependiendo del área geográfica, en EEUU se ha documentado hasta un 48.1% (Lenz, 2014) y en Europa (Sarrazin, 2015) varía dependiendo del país, asi tenemos tasas en Polonia del 75%, Alemania del 29%, UK del 22,6%, Italia del 20%, Bélgica del 18%, Austria del 16%, Suiza del 15,2%, Francia del 13,8% o 10.5% (Morel V, 2014), Holanda del 11,5% España del 8,5%, Portugal del 8,1% y Noruega con un 4,8%. Esta variabilidad se cree se debe a la diferente distribución de los clados I y II que se han descrito para las secencias NS3 (Pickett, 2011). Nosotros hemos obtenido un 80% de prevalencia del clado II en nuestro estudio y está descrito que en este clado la prevalencia del polimorfismo Q80K es baja o nula (De Luca, 2013), de ahí la baja prevalencia encontrada.