Impact of lighting conditions and feeding cycles on rhythms of early development, behaviour and sexual differentiation in zebrafish "Danio rerio"

Resumen

El objetivo de la presente tesis fue investigar el efecto de la luz de diferente longitud de onda y el fotoperiodo durante el desarrollo temprano, el ritmo de eclosión y la actividad locomotora de larvas de pez cebra. Además, el estudio de un sincronizador adicional (alimento) con diferente periodo permitió evaluar los ritmos de alimentación en dos especies. Finalmente, se describió en el pez cebra adulto los ritmos diarios de genes implicados en la diferenciación sexual. Objetivos Específicos: 1 Determinar la ontogenia de la expresión de genes reloj (clock1, bmal1, per1b, per2, dbp) larvas de zebrafish sometidos a ciclos de luz-oscuridad de 12:12 horas, y diferente espectro (LDW, LDB, LDR, DD). 2 Investigar la influencia de varias condiciones de iluminación de diferente longitud de onda, sobre la ontogenia de la actividad locomotora de larvas de pez cebra. 3 Determinar el efecto de los cambios de iluminación de diferente espectro de luz (LDW, LDB, LDR) sobre la actividad locomotora de larvas de zebrafish y la presencia de foto receptores capaces de mediar la respuesta a la luz. 4 Describir la existencia de ritmo de eclosión y la sincronización de embriones a diferentes ciclos de luz (LD, DL1, DL2, LL, DD). 5 Evaluar la existencia de actividad anticipatoria a la comida cuando proporcionada de manera periódica en el pez cebra y el pez hipogeo bajo condiciones oscuridad continua y la capacidad de re-sincronización y la presencia de desplazamientos progresivos de la fase. 6 Describir la variación diaria en la expresión de genes involucrados en la diferenciación sexual en macho y hembra de pez cebra adultos. Metodología: 1 Los embriones se mantuvieron en condiciones de LD 12:12 horas LDW (blanco), LDB (azul) and LDR (rojo). Las larvas se muestrearon el 0,3,7 dpf a ZT3,9,15,21,3. Se extrajo el ARN y se medio la expresión de los genes con qPCR. 2 Embriones fueron mantenidos en LDW, LDB, LDR. Las larvas se grabaron con una cámara y los videos analizados con un software de seguimiento. 3 Larvas mantenidas bajo LDW, LDB, LDR fueron grabada hasta el 11 dpf con una cámara. El 3 dpf se muestrearon y se analizó la existencia de expresión de los genes con PCR. 4 Embriones bajo LD,DL1,DL2,LL y DD a 28°C. Fueron visualizado cada dos horas para calcular la tasa de eclosión 5 Pez cebra y pez de cueva en DD fueron alimentados en manera periódica con comederos automáticos. Se utilizaron fotocélulas de rayo infrarrojo para la grabación de la actividad locomotora y el software "el Temps" para la representación de los datos. 6 Machos y hembras en ciclo LD 12:12, y 28 ºC, fueron muestreados durante un día ZT2,6,10,14,18,22. cerebro y gónadas, Se midieron lo genes de interés en cerebro y gónadas con qPCR. Conclusiones. 1 La ontogenia de la expresión de los genes reloj se desarrolla de manera diferente dependiendo de los ciclos de luz y también de la longitud de onda. Los genes del bucle negativo (per1b and per2) parecen desarrollar antes la ritmicidad, durante el desarrollo, respeto a aquellos del bucle positivo (clock and bmal) que no resulta dependiente de la luz. 2 La actividad locomotora está influenciada por los ciclos de luz, no mostrando ninguna ritmicidad bajo oscuridad continua. El diferente espectro de la luz influye en el inicio de la ritmicidad de las larvas a diferentes momentos. 3 El incremento de la actividad locomotora debido al cambio de iluminación de los ciclos de luz y del diferente espectro está relacionado con la presencia de varios fotorreceptores no visuales presentes desde el día 3 dpf. 4 La eclosión del pez cebra tiene un ritmo diario y está sincronizada a los ciclos de luz-oscuridad. La fase de este ritmo depende del tipo de ciclo de iluminación. 5 La actividad de anticipación al alimento es de origen endógeno en las dos especies. El pez cebra tiene una elevada plasticidad en el encarrilamiento de su ritmo a ciclos de comida de periodo diferente de 24 horas y presenta resincronización gradual tras retrasar la hora de alimentación. 6 La expresión de genes involucrados en la diferenciación sexual en adultos varia durante el día y la fase depende del ciclo de luz y del sexo.