Estudio metabolómico de aislados del género botrytis y caracterización funcional de genes implicados en el metabolismo secundario del fitopatógeno botrytis cinerea

Abstract

La lucha contra las enfermedades causadas por hongos del género Botrytis se lleva a cabo tradicionalmente mediante fungicidas sintéticos, los cuales presentan problemas ambientales, así como toxicidad para los seres humanos. Además, los problemas asociados a la aparición de mecanismos de resistencia a los fungicidas químicos, por parte de estos patógenos, son cada vez mayores. En este contexto, los avances de la biología molecular, particularmente de la genómica, transcriptómica, metabolómica y proteómica, ofrecen nuevas oportunidades para un control más eficiente de estos hongos fitopatógenos. En esta memoria de tesis doctoral se analiza el metabolismo secundario de especies de hongos pertenecientes al género Botrytis, mediante la caracterización bioinformática, química y molecular de genes implicados en la biosíntesis de metabolitos secundarios. Con ello, se pretende determinar la implicación biológica y la funcionalidad de dichos genes, e identificar nuevas dianas moleculares para el control de este género de hongos fitopatógenos. En un primer capítulo de dicha tesis doctoral, se realiza un análisis bioinformático del genoma, una caracterización fenotípica y un análisis químico del metabolismo secundario de especies pertenecientes al género Botrytis tales como Botrytis deweyae B1, Botrytis pseudocinerea VD165 y el aislado apatogénico B459 de B. cinerea. De esta forma, se identifica B. deweyae como superproductor del sesquiterpeno botridial y sus derivados, B. pseudocinerea como superproductor de los policétidos botcininas y derivados, y el aislado B459 de B. cinerea como una cepa incapaz de sintetizar ninguna de las dos toxinas (botridial y botcininas). Además, se realiza una aproximación bioinformática de los genes que conforman clústeres en B. deweyae B1 involucrados en el metabolismo secundario, identificándose nuevos clústeres de genes ausentes en el genoma de B. cinerea B05.10. Finalmente, se lleva a cabo una caracterización del transportador MfsG empleando especies que presentan y carecen de dicho transportador, observándose diferencias significativas en la tolerancia a los isotiocianatos, así como en la capacidad infectiva sobre sustratos vegetales con un elevado índice de producción de esta familia de metabolitos. En un segundo capítulo de la presente tesis doctoral se lleva a cabo la secuenciación y anotación del genoma de la cepa silvestre UCA992 de B. cinerea, así como la caracterización de la familia génica Bcstc de B. cinerea UCA992. Para ello, se realizó una caracterización bioinformática, fenotípica y funcional de los mutantes nulos y sobreexpresados en los genes Bcstc3 y Bcstc4 con el objetivo elucidar la función biológica de dichas proteínas en la biología de B. cinerea. De esta forma, se observaron diferencias en infectividad, crecimiento, tolerancia a condiciones de estrés, expresión de otras Bcstc, así como en la capacidad de producción de conidios entre cepas. Por otro lado, se realizó una caracterización funcional de las proteínas BcStc1 y BcStc7 mediante expresión heteróloga en levaduras y bacterias para la producción heteróloga del compuesto. Se determinó la presencia del sesquiterpeno presilfiperfolan-8beta-ol en la expresión heteróloga del gen Bcstc1 y del sesquiterpeno ( )-5-epiaristolochene en la expresión heteróloga del gen Bcstc7 mediante espectrometría de gases-masas. Finalmente, en un tercer capítulo de esta tesis doctoral, mediante la generación de transformantes utilizando la técnica de edición genética CRISPR/Cas9, se aborda la identificación de nuevos factores de virulencia en B. cinerea. De esta forma, se estudiaron y caracterizaron las condiciones idóneas de generación de protoplastos funcionales en aislados no esporogénicos para su transformación por CRISPR/Cas9. Asimismo, se generaron mutantes nulos y sobreexpresados de los genes que codifican para las policétido sintasas 8 y 14 (Bcpks8 y Bcpks14), observándose diferencias en la capacidad infectiva entre los distintos transformantes obtenidos. Por otro lado, se complementó con una copia funcional y se reparó el gen regulador transcripcional Bcin04g03490 en el aislado B459 de B. cinerea, observándose su implicación en la síntesis de metabolitos secundarios, crecimiento, esporulación y capacidad infectiva. Finalmente, se reparó el transportador ABC de B. cinerea B05.10 (BcatrT) mediante la técnica de edición genética CRISPR/Cas9, implicado presuntamente en el bombeo de alfa-tomatina al exterior celular, observándose un leve incremento tanto de la tolerancia a este compuesto, así como de la infección en hojas de tomate.