Utilidad clínica de la detección y cuantificación de adn y arn en plasma de pacientes con carcinoma de células renales

Resumen

INTRODUCCIÓN El carcinoma de células renales (CCR) representa el 2% de todos los tumores en el ser humano y es la 3ª neoplasia urológica en frecuencia. Es la lesión sólida más frecuente en el riñón y supone el 90% de todos los tumores renales malignos. Engloba diferentes subtipos, con características histopatológicas y genéticas específicas. Respecto a sus factores de riesgo destacan el tabaquismo, la obesidad y la exposición ocupacional. El CCR es una entidad clínica que se define por su heterogeneidad, con múltiples formas de presentación a nivel clínico e histológico que lo convierten en una patología compleja. Existe actualmente una tendencia al diagnóstico incidental, facilitado por las mejoras tecnológicas en las pruebas de imagen, así como la accesibilidad relativamente frecuente a las mismas. Actualmente no existe un marcador tumoral ni de diagnóstico precoz definido para esta patología. La posibilidad de contar con un marcador tumoral fiable en cáncer renal sería fundamental para categorizar y tratar adecuadamente una masa renal, permitiendo aumentar los diagnósticos en estadios más tempranos y favoreciendo un tratamiento precoz que implicaría mejoras importantes en el pronóstico de esta enfermedad. La biopsia clásica de tejido ante la sospecha de lesión tumoral has sido el gold estándar en oncología. En el CCR este procedimiento, si bien es relativamente infrecuente en la práctica diaria, asocia importantes inconvenientes para el paciente, como invasividad y problemas perioperatorios, necesidad de anestesia, etc. En este sentido, el creciente interés de los hallazgos sobre los ácidos nucleicos libres en plasma, ha hecho que la “biopsia líquida” pueda ser una alternativa válida en diferentes líquidos biológicos. Esta técnica posibilita la toma de muestras repetidas, poco invasivas y reproducibles en el tiempo, lo que facilitaría el control en la evolución y progresión de la enfermedad, en contraposición a la imagen estática aportada por una biopsia tradicional. Es por ello, que en el presente trabajo se planteen como objetivos: OBJETIVOS Objetivo general. Evaluar la utilidad clínica de la detección y cuantificación de ADN y ARNm en plasma de pacientes con cáncer de células renales. Objetivos específicos. a.- Evaluar la utilidad clínica y pronóstica de la expresión del gen que codifica la telomerasa humana en tejido tumoral y plasma. b.- Evaluar la utilidad de la cuantificación de ADN y de ARNm (hTERT y GAPDH) en plasma como herramienta diagnóstica del cáncer de células renales. c.- Analizar la correlación entre los niveles de ADN y ARNm plasmáticos y las características clínico-patológicas del tumor. d.- Analizar la correlación entre los niveles de ADN y ARNm plasmáticos y la evolución clínica tras el tratamiento y seguimiento a largo plazo. MATERIAL Y MÉTODOS Se trata de un estudio de cohortes prospectivo formado por 120 pacientes diagnosticados de CCR y tratados quirúrgicamente en la GAI de Albacete. La muestra final del estudio fue de 111 muestras de tejido tumoral de CCR y 94 muestras de tejido pareado sano. Para el análisis de los plasmas se utilizó un grupo control, tras comprobar la ausencia de cualquier antecedente de enfermedad oncológica. Para la detección y cuantificación plasmática de ARNm se emplearon muestras de 77 pacientes y 31 controles, mientras que el análisis de ADN se utilizaron 61 muestras y 22 controles. De cada uno de los pacientes incluidos se extrajeron muestras de sangre periférica en el preoperatorio, postoperatorio inmediato (3-5 días), y un año después de la intervención, junto con el análisis paralelo de muestras de tejido tumoral y tejido renal sano adyacente de su pieza quirúrgica. Las muestras de nefrectomías fueron sometidas al estudio anatomopatológico protocolizado. Además, mediante el Biobanco de tumores de nuestro centro, se realizó la extracción de ARNm tanto de las muestras tumorales como de las de tejido sano adyacente al tumor, utilizando para ello kits comerciales. Posteriormente se aplicó una técnica de PCR-RT para detectar el ARNm específico (tanto para hTERT como para GAPDH). El análisis de plasma implicó la extracción y cuantificación de ADN y ARNm mediante PCR-RT, igualmente dirigido a la determinación de los biomarcadores hTERT y GAPDH en cada una de las muestras. En los voluntarios sanos se realizó una única determinación plasmática de cada uno de los parámetros analizados. Igualmente se analizaron variables socio-demográficas, clínicas, histopatológicas, factores de riesgo conocidos y respuesta a tratamientos complementarios. Se realizó un análisis descriptivo para describir la distribución de cada variable, un análisis de supervivencia y un análisis de rendimiento diagnóstico como método de medida global de la exactitud de la prueba en la predicción de recidiva o exitus por CCR. El estudio fue aprobado por el Comité Ético de Investigación Clínica de nuestro centro, autorizando todos los sujetos incluidos su participación mediante la firma del consentimiento informado. RESULTADOS: 1.- Análisis descriptivo de la muestra. La muestra estuvo compuesta por 120 pacientes (84 varones y 36 mujeres), con una edad media de 60.7 años. Más del 50% de los pacientes presentaron factores de riesgo para CCR. El tamaño medio de la lesión fue de 5.5cm, con predominio histológico de CCRcc y presentaron en 52% de los casos un grado de diferenciación nuclear de Furhman de 2. 2.- Detección de ARNm en muestra de tejido. Todas las muestras de tejido tumoral y de tejido pareado adyacente al tumor expresaron GAPDH ARNm, siendo el Cp de muestras tumorales significativamente inferior al de las pareadas. Respecto a la expresión de hTERT ARNm, el 68% de las muestras tumorales lo expresaron frente a un 33% de las pareadas sanas. Las diferencias en la expresión de hTERT ARNm según los diferentes subtipos histológicos fueron estadísticamente significativas (p < 0.0001), destacando que el Cp de los CCR con diferenciación sarcomatoide fue menor al del resto de subtipos histológicos (media: 29,2; IC95; 22.1 -36.20; p < 0,001). Igualmente, el Cp de los tumores metastásicos, con afectación ganglionar y los estadios TNM IV fue significativamente inferior al de lesiones localizadas. 3.- Detección y cuantificación de ARN en plasma. El análisis de GAPDH ARNm en plasma dio valores significativamente más elevados en muestras preoperatorias de pacientes que en voluntarios sanos. Tras la nefrectomía estos valores disminuyeron progresivamente hasta ser inferiores, al año de la intervención, a los determinados inicialmente en sujetos sanos. Destacó especialmente la relación que la cuantificación de GAPDH ARNm pre- y postoperatoria en plasma estableció con el estadio M y la progresión clínica. La cuantificación de hTERT ARNm en plasma fue negativa en casi todos los casos. 4.- Detección y cuantificación de ADN en plasma. La detección de hTERT ADN en plasma no se evidenció en ninguno de los 22 controles analizados, mientras que sí se pudo comprobar en el 54,1% de los pacientes. En el análisis de éstos, destacó la relación de su detección preoperatoria con la progresión de enfermedad y con los grados Furhman 3 y 4. Del mismo modo, los niveles postoperatorios se asociaron con los estadios N y M, mientras que la determinación al año de la nefrectomía se relacionó con los grados Furhman más elevados. El análisis cuantitativo de GAPDH ADN como marcador en plasma se asoció, tanto pre- como postoperatoriamente, con los estadios T, M y TNM, así como con la progresión clínica. Igualmente, su determinación durante el seguimiento (muestra anual) se asoció con el subtipo histológico de células claras (CCRcc), el estadio M y la progresión clínica. 5.- Rendimiento diagnóstico de la cuantificación de ADN y ARNm en plasma. El análisis de la exactitud diagnóstica de los marcadores utilizados en la predicción de progresión y mortalidad mostró que el valor de GAPDH ADN plasmático de un paciente que progresa durante el seguimiento, tiene una probabilidad del 92,2% de ser más alto que el de uno que permanece estable (p = 0,045) y que el valor de GAPDH ARNm postoperatorio de un paciente que progresa tiene un 91,3% de ser más alto que el de uno que permanece estable (p = 0,049). CONCLUSIONES En las muestras de tumor de pacientes con carcinoma de células renales, fue frecuente, aunque no generalizada, la expresión de ARNm del gen hTERT, asociándose a determinados subtipos histológicos (célula clara y con diferenciación sarcomatoide) y a estadios avanzados. Del mismo modo, los pacientes con CCR presentaron niveles plasmáticos de ARNm del gen GAPDH más elevados que los voluntarios sanos. Asimismo, los niveles plasmáticos de ARNm del gen GAPDH pre y postoperatorios se relacionaron con progresión clínica. La detección de altos niveles de ADN plasmático en pacientes con carcinoma renal se asoció con variables clinico-patológicas de mal pronóstico. Por todo ello, la determinación en tumor y plasma de estos biomarcadores podría considerarse como una herramienta más en el diagnóstico, pronóstico y seguimiento de pacientes, si bien serían necesarios estudios más amplios y a largo plazo para confirmar estos hallazgos.