Producción biotecnológica de d-diboa mediante escherichia coli

  1. de la Calle Sierra, María Elena
Supervised by:
  1. Gema Cabrera Revuelta Director
  2. Jorge Bolívar Pérez Director

Defence university: Universidad de Cádiz

Fecha de defensa: 22 March 2019

Committee:
  1. Juan Parrado Rubio Chair
  2. Nuria Chinchilla Secretary
  3. Isabel Muñoz Barroso Committee member
Department:
  1. Ingeniería Química y Tecnología de Alimentos

Type: Thesis

Teseo: 585573 DIALNET

Abstract

La síntesis química del D-DIBOA (4-hidroxi-(2H)-1,4-benzoxacin-3(4H)-ona), compuesto con destacadas propiedades fitotóxicas, se ha simplificado en dos etapas. Sin embargo, este proceso presenta ciertos problemas de escalado ya que la segunda de estas etapas, que tiene un rendimiento del 70%, consiste en una catálisis heterogénea en la que se utiliza un costoso catalizador y en la que se produce desprendimiento de hidrógeno con el consiguiente riesgo de explosión. La producción biotecnológica de este compuesto empleando Escherichia coli como biocatalizador de la segunda etapa de esta síntesis se puede considerar una interesante estrategia alternativa, ya que las reacciones biológicas se producen bajo condiciones de operación más suaves y, generalmente, son más respetuosas con el medio ambiente. Previamente, esta biotransformación había sido llevada a cabo con rendimientos de hasta el 60%, empleando una cepa modificada genéticamente de E. coli con capacidad para sobreexpresar la enzima autóloga NfsB, identificada como la principal responsable de este bioproceso. Debido al carácter NAD(P)H-dependiente de esta nitrorreductasa, se consideró que la disponibilidad de estos cofactores podría ser un factor limitante, por lo que se razonó que un incremento en la disponibilidad de este y/u otros recursos metabólicos podría mejorar este proceso. Teniendo en cuenta estos antecedentes, en el presente estudio se han desarrollado varias estrategias con el objetivo de optimizar la producción de D-DIBOA. Para ello, inicialmente se establecieron las condiciones de cultivo más adecuadas en las que llevar a cabo el proceso de biotransformación. Una vez estandarizado este procedimiento, se realizó un screening con 34 cepas mutantes, previamente seleccionadas, que pudiesen aportar a la sobreexpresión de la enzima NfsB una mayor disponibilidad de cofactores reducidos u otros recursos metabólicos al proceso de biotransformación. Como resultado de este screening, se identificaron dos cepas con una producción destacable, por lo que se procedió a la construcción de un doble mutante con el cual, tras una nueva adaptación de las condiciones de cultivo específicas para esta cepa, se lograron rendimientos de biotransformación del 90%. Es más, tras la implementación de una nueva estrategia de cultivo mediante la alimentación por lotes del precursor, se consiguió alcanzar rendimientos del 100% o incrementar la concentración de D-DIBOA hasta 379% respecto a lo descrito previamente. Por otra parte, se evaluó la posibilidad de la producción biológica de dos compuestos análogos a D-DIBOA, los compuestos 6-Cl-D-DIBOA y 8-Cl-D-DIBOA, con propiedades fitotóxicas mejoradas. En este caso, los máximos rendimientos obtenidos mediante biocatálisis celular fueron 59 y 46%, respectivamente, aunque es probable que la optimización del fondo genético de la cepa empleada, así como de las condiciones de cultivo puedan incrementar estos rendimientos de manera notable. Además, se estudió la viabilidad de llevar a cabo la biotransformación para la síntesis de D-DIBOA, 6-Cl-D-DIBOA y 8-Cl-D-DIBOA a partir de sus correspondientes precursores parcialmente purificados. Con esta estrategia se evitarían algunas de las etapas de separación-purificación previas y, por tanto, el elevado gasto de disolventes orgánicos y otros recursos que llevan asociados, lo que incrementaría la rentabilidad del proceso global. Finalmente, para comprender mejor el mecanismo de biocatálisis en cada una de las tres biotransformaciones estudiadas, se produjo y purificó la enzima recombinante NfsB con la que se llevaron a cabo reacciones in vitro. Los resultados de estos estudios revelaron que la cinética de reacción corresponde a la de una enzima alostérica. El rendimiento de la biotransformación obtenido mediante la reacción in vitro para D-DIBOA fue del 65%, disminuyendo respecto al obtenido mediante la biocatálisis celular. Por el contrario, los rendimientos alcanzados de la biocatálisis mediante la enzima para la producción de 6-Cl-D-DIBOA y 8-Cl-D-DIBOA incrementó hasta un 82 y 97%, respectivamente, mejorando notablemente los resultados obtenidos mediante biocatálisis celular para estos productos. Además, el estudio de la cinética enzimática in vitro ha permitido demostrar el efecto inhibitorio que presenta el reactivo de partida de la síntesis química del precursor, el cual está presente en ciertos precursores no puros, Los resultados obtenidos en este trabajo hacen posible abordar un escalado del proceso de biosíntesis de estos interesantes compuestos con potencial aplicación como productos herbicidas.