Contribución de cd38 al desarrollo de la artritis autoinmune inducida por colágeno en un modelo murinoestudios proteómicos y funcionales

Resumen

Está aceptado de forma generalizada el empleo de modelos animales para profundizar en el conocimiento de la patogénesis de las enfermedades humanas y como plataforma para la comprobación de posibles dianas terapéuticas. Como modelo de la Artritis Reumatoide humana (AR), un modelo animal en ratón bien establecido es la artritis inducida mediante la inyección de colágeno heterólogo tipo II (AIC). La AR es una enfermedad autoinmune y sistémica caracterizada por una progresiva degeneración de las articulaciones acompañada de inflamación con el resultado de la destrucción del hueso y cartílago. Aunque han sido descritos ciertos factores genéticos y ambientales que se asocian con la aparición de la enfermedad, la etiología de esta patología es desconocida y de ahí el interés en su estudio. En nuestro caso empleamos los ratones B6 que en el modelo de AIC presentan una gran semejanza a la AR humana en términos de progresión de la enfermedad, manifestaciones histológicas y respuesta de los fármacos antiartríticos más comúnmente usados. El objetivo general de esta Tesis Doctoral era determinar la contribución de la molécula CD38 al desarrollo de la AR en este modelo de artritis inducida comparando ratones silvestres (WT) con ratones deficientes para CD38. La molécula CD38 es una glicoproteína transmembrana de tipo II presente en numerosas células del sistema inmunitario caracterizada por su dualidad funcional al ser capaz de actuar como enzima y como receptor. Como enzima, CD38 cataliza la síntesis de cADPR y NAADP a partir de NAD+ y NADP+ respectivamente, además de mediar la hidrólisis del cADPR hasta ADPR. La producción de estas moléculas regula la movilización de Ca2+ con consecuencias en numerosos procesos biológicos como proliferación, metabolismo de la insulina, etc. En los ratones CD38ko, se ha descrito que la falta de la actividad enzimática de CD38 tiene consecuencias negativas en la movilización y migración de neutrófilos, células dendríticas, etc. Como receptor, CD38 se relaciona con procesos de activación y proliferación en linfocitos T y se asocia física y funcionalmente con el TCR/CD3 en linfocitos T y con el complejo CD19/CD81 en linfocitos B para desempeñar su función receptora. Dado su amplio espectro de expresión en diversas células del sistema inmunitario y a su doble función se ha propuesto que CD38 podría ejercer un papel regulador de las respuestas inmunológicas innata y adaptativa actuando como nexo de unión entre ellas. Es por ello que su estudio resulta de gran interés por el papel que pudiera tener sobre el desarrollo de la artritis autoinmune. En un trabajo reciente publicado en colaboración con los laboratorios de los Doctores Ramón Merino (CSIC) y Jesús Merino (Universidad de Cantabria) se demuestra que los ratones CD38ko desarrollan una forma atenuada de la artritis inducida por colágeno en comparación con los ratones WT. Esta menor afectación clínica estaba acompañada por una limitada inducción en articulaciones de citoquinas proinflamatorias, una producción de anticuerpos anti-colágeno alterada que sugería una respuesta Th1/Th2 deficiente, corroborado por una menor inducción de linfocitos Th1 en los ganglios linfáticos de estos ratones y por un menor porcentaje de células NKT invariantes en bazo. En la presente Tesis Doctoral se ha realizado una aproximación proteómica para determinar en el suero de ratones WT y CD38ko perfiles de expresión proteicos que explicaran la distinta respuesta ante la artritis inducida. Mediante análisis cuantitativo de expresión diferencial mediante 2D-DIGE e identificación de las proteínas por espectrometrías de masa y el análisis multivariante de las proteínas diferencialmente expresadas se pudieron definir una serie de proteínas relacionadas con inflamación, las apolipoproteínas y el complemento que resultaron de interés para catalogar los dos tipos de ratones en función de la respuesta ante la inmunización con Col.II+CFA. Por otro lado, se realizó un estudio proteómico de expresión diferencial en el suero de ratones WT y CD38ko tratados con CFA/IFA para determinar la contribución del adyuvante empleado en la inmunización con Col. II sobre las proteínas expresadas diferencialmente. Como resultado, se identificaron algunas proteínas coincidentes con las halladas en la comparación entre los ratones inmunizados con Col.II+CFA, pero algunas de ellas eran únicas para estos últimos, indicando la distinta respuesta de los ratones WT y CD38ko a la artritis inducida por colágeno. Mediante ELISA y Western Blot se han confirmado las diferencias halladas entre ciertas proteínas como SAA, Ficolina-1 o la subunidad ligera kappa de las inmunoglobulinas que además resultaron de utilidad para explicar el diferente status inflamatorio y clínico de la artritis inducida. El incremento de algunas citoquinas proinflamatorias en el suero de los ratones WT respecto a los CD38ko apoya este supuesto. Previamente a los estudios proteómicos de expresión diferencial en suero se realizó un estudio sobre el fraccionamiento del suero mediante el empleo de un sistema de ecualización de la muestra basado en el empleo de librerías de hexapéptidos, conocido con el nombre de ProteoMiner. El amplio rango dinámico de concentraciones séricas hace necesario el fraccionamiento de la muestra para aplicaciones posteriores, ya que la presencia de una serie de proteínas con concentración mayoritaria limita la detección de proteínas poco abundantes que pueden ser funcionalmente relevantes o actuar como biomarcadores. Mediante el empleo de este sistema de librerías de hexapéptidos se consiguió detectar e identificar en geles 1D y 2-D una serie de proteínas con una concentración en suero media y baja, que en el suero sin fraccionar no pueden detectarse. Algunas de ellas coinciden con aquellas que se expresan diferencialmente entre los ratones WT y CD38ko con la artritis inducida. Por otro lado, se han realizado estudios de fenotipado de poblaciones linfocitarias en órganos linfoides y sangre durante el curso de la enfermedad, centrados sobre todo en células de origen mieloide (monocitos y neutrófilos) mediante marcadores específicos de estas subpoblaciones, además de receptores de quimiquinas como CCR2 y CD184 que permitieron evaluar y establecer un patrón de respuesta celular ante la inmunización, y determinar cómo en los ratones WT la mayor sensibilidad al desarrollo de la artritis tenía reflejo sobre estas poblaciones celulares. Además, se han realizado experimentos de diferenciación in vitro hasta osteoclastos y ensayos sobre el papel que la inducción de las células iNKT tienen sobre el metabolismo óseo y la generación de precursores de osteoclastos en médula ósea para intentar explicar la menor destrucción del hueso que se observa en las articulaciones de ratones CD38ko respecto a los ratones WT en el modelo de artritis inducida.