Mecanismos de diferenciación neuronal a partir de células madre neurales. Adam17 (tace) como nueva diana terapéutica en lesiones cerebrales

Resumen

Las lesiones cerebrales de diversas etiologías (traumática, isquémica, neurodegenerativa, etc) llevan consigo una pérdida irreversible de neuronas que puede contribuir al desarrollo de patologías cognitivas, motoras, somatosensoriales, o incluso de la personalidad. Este tipo de lesiones no tienen tratamiento efectivo en la actualidad por lo que la búsqueda de terapias que ayuden a regenerar el tejido dañado evitando la pérdida de función es uno de los desafíos de la ciencia actual. Uno de los mecanismos a través de los cuales podría facilitarse la regeneración de lesiones en el SNC es favorecer la neurogénesis promoviendo la diferenciación de precursores neurales hacia la estirpe neuronal dentro de las áreas lesionadas. La proteína ADAM17, su sustrato TGF alfa y el receptor de éste, EGFR, se sobreexpresan en lesiones cerebrales pudiendo ser la causa del ambiente gliogénico/no-neurogénico que existe en este tipo de lesiones; dado que la inhibición de ADAM17 in vitro favorece la diferenciación a neurona de los precursores neurales, NPC, inhibir la actividad de esta metaloproteasa en la lesión podría resultar en la generación de nuevas neuronas en las lesiones. No existen, sin embargo, inhibidores comerciales específicos de ADAM17 por lo que la inhibición de esta enzima podría conseguirse bien mediante el tratamiento de lesiones con un inhibidor general de metaloproteasas, bien mediante el diseño de una herramienta de terapia génica que permitiese la sobreexpresión en lesiones de una proteína mutante con efecto dominante negativo sobre ADAM17. Hipótesis La inhibición de la actividad de ADAM17 en lesiones mecánicas de la corteza cerebral de ratones adultos promueve la formación de nuevas neuronas a partir de precursores neurales endógenos. Desarrollo de la Tesis Con esta Tesis doctoral diseñamos un modelo de lesión traumática consistente en lesiones mecánicas en la corteza de ratón adulto y realizamos una caracterización temporal de la neurogénesis en este tipo de lesiones. Por otro lado también estudiamos la inhibición de la actividad metaloproteasa in vivo en lesiones mecánicas de la corteza cerebral. Determinamos los efectos del inhibidor general GM6001 sobre la generación de neuronas en lesiones corticales de ratones adultos en diferentes momentos del tratamiento. Gracias a estudios previos realizados por nuestro equipo de investigación, en el que se identificó a la metaloproteasa ADAM17 como una de las moléculas responsables de la creación del nicho anti-neurogénico, dirigimos nuestros esfuerzos en la generación de una herramienta molecular que permita la inhibición específica de ADAM17, ya que, no existen inhibidores químicos comerciales efectivos. Generamos de un vector de expresión en células de mamífero que codificaba a la proteína mutante ADAM17∆215-473, con efecto dominante negativo sobre la actividad proteolítica de ADAM17. Posteriormente analizamos la eficacia de esta herramienta para bloquear la actividad de ADAM17 en cultivos de precursores neurales, tanto a nivel molecular como funcional. Comprobada la efectividad de nuestra herramienta construimos un vector lentiviral que permitiera la expresión del mutante dominante negativo ADAM17∆215-473 en lesiones traumáticas de la corteza cerebral. Posteriormente analizamos si el tratamiento con esta herramienta de terapia génica favorece la formación de nuevas neuronas en las zonas de lesión in vivo. Finalmente analizamos las características funcionales de las neuronas generadas mediante el tratamiento. Conclusiones obtenidas 1. En lesiones mecánicas de la corteza motora de ratones adultos se observa la aparición temprana de células proliferantes que se corresponden con precursores indiferenciados. A los 14 días post-lesión la proliferación disminuye considerablemente de forma concomitante con un aumento en la diferenciación glial. 2. El tratamiento de lesiones mecánicas en la corteza motora de ratones adultos, con el inhibidor general de metaloproteasas GM6001, incrementa el número de precursores indiferenciados proliferantes en la lesión, induce su diferenciación a neuroblastos y disminuye su diferenciación hacia el fenotipo glial, en el contorno de la lesión. 3. Parte de los neuroblastos generados en el perímetro de la lesión, maduran y se diferencian a neuronas a largo plazo. 4. La inhibición específica de la metaloproteasa ADAM17 in vitro mediante la sobreexpresión de un mutante dominante negativo de su actividad proteolítica (ADAM17∆215-473) potencia la diferenciación a neuronas de los precursores neurales. 5. Se ha generado un vector lentiviral que contiene la secuencia codificante de un mutante de ADAM17 con efecto dominante negativo sobre la proteína nativa. Este lentivirus infecta a las células localizadas en el entorno de la lesión. 6. La inhibición específica de ADAM17 in vivo mediante un vector lentiviral que expresa la proteína mutante ADAM17∆215-473, con efecto negativo sobre ADAM17, favorece la diferenciación de los precursores neurales a neuroblastos y su maduración a neuronas. 7. El efecto de ADAM17∆215-473 es similar cualitativamente al del inhibidor general de metaloproteasas GM6001, pero mucho mayor cuantitativamente. 8. Las neuronas formadas mediante la infección con el lentivirus ADAM17∆215-473 de lesiones mecánicas en la corteza motora son principalmente neuronas colinérgicas y un pequeño porcentaje son neuronas GABAérgicas.