Regulación por óxido nítrico de la expresión del gen s100a10 en motoneuronasposible implicación en el desarrollo de un modelo de esclerosis lateral amiotrófica

Resumen

El óxido nítrico (NO) es una molécula con alta reactividad, sintetizada por la enzima NO sintasa (NOS), que interviene en multitud de procesos fisiológicos y patológicos. El NO, debido a su carácter gaseoso y liposoluble, posee una gran capacidad de difusión a través de las membranas celulares ejerciendo acciones tanto autocrinas como paracrinas. Uno de los principales mecanismos de acción de este gas viene mediado por la activación de la enzima guanilato ciclasa soluble (GCs), que aumenta los niveles de GMP cíclico (GMPc) en las estructuras diana activando a la proteína quinasa G (PKG). S100A10, también llamada cadena ligera de la anexina II o p11, interviene en el tráfico de multitud de proteínas que forman parte de canales iónicos y receptores para neurotransmisores en neuronas. Una de las funciones de interés para nuestro trabajo es que S100A10 actúa como factor de retención en retículo endoplásmico de la subunidad TASK1 (TWIK-related acid-sensitive K+), regulando así la expresión de esta subunidad en membrana plasmática. Recientemente, nuestro grupo ha demostrado que la activación a largo plazo de la vía NO/GCs/PKG aumenta la excitabilidad neuronal por inhibición de corrientes de fuga de K+ tipo TASK en motoneuronas, una acción que depende de la vía de señalización mediada por la pequeña GTPasa RhoA y su principal efector Rho quinasa (ROCK). Esta acción a largo plazo del NO sobre las corrientes tipo TASK implica la sobre-expresión de S100A10 y la retención en retículo de TASK1. Así los principales objetivos de este trabajo han consistido en estudiar si la vía NO/GMPc/PKG-RhoA/ROCK regula la actividad del promotor S100A10 y, si la modulación de la expresión de este factor de retención regula la actividad de las motoneuronas así como su posible implicación en el proceso de degeneración de motoneuronas en dos modelos de patologías motoras. En primer lugar transfectamos la línea celular de motoneuronas NSC34 con parte del promotor de S100A10 humano dentro de un vector reportero que expresa la enzima luciferasa. Para caracterizar la actividad del promotor medimos la actividad luciferasa mediante luminometría respecto al vector normalizador Tk-rell, el cual expresa constitutivamente otro tipo de luciferasa a la expresada bajo la regulación del promotor de S100A10. Tras incubar las células con DETA/NO (1 mM), un donante de vida media larga de NO, se observó un fuerte aumento (+300 ± 31%) de la actividad luciferasa con respecto al fármaco control DETA (1 mM). Este aumento se evitó por co-adición al medio de ODQ (20 µM), Rp-8-pCPT-cGMPS (1 µM), y H-1152 (10 µM), inhibidores específicos de GCs, PKG y ROCK, respectivamente. Estos resultados indican que el NO aumenta la activad del promotor de S100A10 humano en la línea celular de motoneuronas NSC34 a través de la ruta GCs/PKG, por un mecanismo dependiente de la vía de señalización RhoA/ROCK. A continuación determinamos la mínima parte del promotor humano que respondía a la estimulación por NO. En este sentido hicimos deleciones en 5¿ desde el inicio de la transcripción e identificamos cuales de ellas se estimulaban por DETA/NO. Así detectamos una pequeña porción del promotor de apenas 24 bases situada entre -96 y -70 pares de bases desde el inicio de la transcripción claves para esta respuesta, la cual poseía una secuencia consenso para el factor de transcripción Sp1. Estudios mediante el uso de ensayos de movilidad electroforética (EMSA) y mutagénesis dirigida del sitio de unión, demostraron que al menos el Sp1 se unía a esa región. Además la inhibición farmacológica mediante un policétido bacteriano (PB) de Sp1 al ADN impidió la activación por NO del promotor. La relación entre Sp1 y regulación de la expresión de S100A10 se ve reforzada por el paralelismo observado en los patrones de expresión de S100A10 y Sp1 en NSC34 en respuesta a NO, así como en motoneuronas espinales durante el desarrollo embrionario y en cultivo. Estos resultados fueron la base para el desarrollo de herramientas genéticas que regularan la expresión de S100A10 directamente o a través de su factor trans-activador Sp1. Para ello se desarrollaron, en colaboración con el equipo del Dr. Sergey Kasparov (Universidad de Bristol), partículas lentivirales, promotor específicas de neuronas, que expresaban un shRNA (Small hairpin RNA) dirigido contra el ARNm para S100A10 (LV-shRNAs100a10), sobre-expresaban S100A10 (LV-s100s10) o dirigían la expresión de un dominante negativo para Sp1 (LV-DNsp1). Como control negativo se utilizó una partícula viral que expresaba un shRNA contra un ARNm no presente en eucariotas, lacZ (LV-Control). La incubación de cultivos primarios de motoneuronas espinales de ratón con estos virus indujo una disminución en la expresión de S100A10 para LV-shRNAs100a10 y LV-DNsp1 y un aumento en respuesta al LV-s100a10, respecto al efecto de la incubación con el virus control. Posteriormente, el efecto de la microinyección en el núcleo hipogloso (NH) de los virus el LV-shRNAs100a10 y control sobre las propiedades de disparo de la motoneuronas del núcleo hipogloso (MNHs) fue testado en ratas adultas. Tras diez días de infección el LV-shRNAs100a10 disminuyó eficientemente la expresión de S100A10 en el NH respecto al virus control. De manera interesante, mediante el registro extracelular unitario de sus las MNHs, observamos un descenso en la respuesta de las motoneuronas ante sus aferencias excitatorias en condiciones basales y tras las modulación sensorial de la actividad de estas entradas sinápticas. Estos resultados muestran que S100A10 tiene un papel relevante en el control de la actividad de las MNHs en el animal adulto, probablemente, el mecanismo implique la regulación de la expresión en membrana de las subunidades TASK1 y, como consecuencia, la modulación de la excitabilidad de las motoneuornas. Esta hipótesis fue apoyada por el hecho de que el tratamiento durante dos días de ratas adultas con el PB (30 ug/Kg/día, vía oral), inhibidor de la unión de Sp1 al ADN, indujo un descenso en la expresión de S100A10 en el NH y cambios en la actividad de las motoneuronas similares a los inducidos por el LV-shRNAs100a10. Ambos abordajes fueron aplicados a dos modelos de patología motora en ratones. Por un lado, la transección del par craneal XII, que conlleva a la muerte principalmente por excitotoxicidad de gran parte de las MNHs, se caracterizó por presentar un amento en la expresión de S100A10 y Sp1 y, una disminución de la expresión de TASK1, uno y siete días después de la lesión. Fue interesante observar que tanto la administración local del LV-shRNAs100a10 como la administración crónica del PB en el agua de bebida protegieron a la MNHs ante la degeneración inducida por la lesión de sus axones. Por otro lado, durante el curso de la enfermedad de ratones SODG93A, un modelo de esclerosis lateral amiotrófica (ELA), se observó en animales con 4 meses de edad (sintomáticos), un patrón de expresión de la triada Sp1/S100A10/TASK1 similar a la observada en el modelo de lesión. Además, el tratamiento crónico con el PB aumentó significativamente la curva de supervivencia de dichos ratones. Finalmente, demostramos que tanto la inhibición de la expresión de S100A10 mediante el lentivirus y como el tratamiento con el lentivirus que expresaba la versión truncada de Sp1, protegieron a cultivos primarios de motoneuronas espinales de ratón ante estímulos excitotóxicos.