Identificación de moléculas con actividad inmunomoduladoras y estudio de la relación estructura-actividad

Resumen

Identificación de Moléculas con Actividad Inmunomoduladoras y Estudio de la Relación Estructura Actividad La gran diversidad de actividades biológicas que presenta la familia de los sesquiterpenos (en especial las lactonas sesquiterpénicas), los hacen especialmente atractivos para su estudio como agentes bioactivos. La acción de los sesquiterpenos estudiados, sugieren que este tipo de moléculas pueden ser potenciales agentes terapéuticos con posible utilización en todas aquellas patologías relacionadas con la hiperactivación del sistema inmune, como pueden ser alergias y autoinmunidad, así como los efectos inhibidores del crecimiento tumoral. La actividad antiproliferativa de estos compuestos permitirá así mismo explorar su actividad como agentes anergizantes. El estudio se realizó sobre sesquiterpenos heliannuolidos (HE-1-HE-12) seleccionados tras un primer escrutinio, mediante ensayos de fitotoxicidad. Un escrutinio realizado sobre células tumorales, nos muestra como tres de estos compuestos son capaces de inhibir la proliferación tanto de células tumorales como de células primarias de ratón y más importante aun de células CD4+ humanas. Los heliannósidos HE-2 yHE-4 muestran un efecto más potente sobre todos los tipos celulares que el heliannósido HE-9 que en algunos tipos celulares no es capaz de ejercer su acción como por ejemplo sobre la línea celular de ratón D5. Otras moléculas de esta familia de terpenos, y concretamente sesquiterpenos, son compuestos con un amplio espectro de actividades biologicas. Entre los efectos descritos de los sesquiterpenos podemos encontrar efecto sobre la producción de NO y la activación del factor de transcripcion NFkB, así como en el desarrollo de efectos antiinflamatorios determinados. Este efecto sobre la proliferación nos dio las bases para seguir analizando el posible efecto de estos compuestos. Tras diversos ensayos, determinamos que la inhibición de la proliferación correlacionaba directamente con una parada en el ciclo celular. Sin embargo, el heliannósido HE-9, no produce el mismo efecto en los linfocitos humanos. La inhibición de la proliferación se debe por tanto a un efecto sobre el ciclo celular en dos de los tres compuestos que mostraron mejores perfiles de actividad. Estos compuestos también tienen efecto sobre los linfocitos vírgenes, no estimulados, puesto que cuando estos linfocitos vírgenes son tratados con helinanósidos, antes de su primera estimulación, sufren un retraso en la entrada en ciclo, comenzando ésta a partir de las 96h de la estimulación, indicando que el efecto de los helinanósidos es reversible y no daña de forma permanente a las células puesto que las células comienzan a recuperar sus funciones y a entrar en ciclo probablemente como consecuencia de una degradación del sesquiterpeno. El hecho de que la no proliferación sea debida a una parada del ciclo, nos indica que el efecto de los heliannósidos sobre la célula provoca un cambio profundo capaz de ignorar las complejas cascadas de señalización que se producen durante la activación de las células. Es importante además estudiar la viabilidad y la supervivencia de las células que están expuestas a los heliannósidos, puesto que, esta parada en ciclo puede deberse a la inducción de muerte celular de aquellas células que se ven afectadas por el sesquiterpeno en una determinada fase del ciclo. Sin embargo, los diferentes ensayos de apoptosis muestran que si bien el porcentaje de muerte celular aumenta tras el tratamiento con las biomoleculas, este efecto es observable para los tres heliannósidos que tienen efectos distintos en la distribución del ciclo y por otro lado este aumento en la apoptosis no es suficiente como para ser responsable de la parada del ciclo y el bloqueo de la proliferación. Nuestros resultados en células primarias humanas, muestran un efecto de los heliannósidos, fundamentalmente HE-2 y HE-4 y en menor medida HE-9, en la secreción de las citoquinas IL2, IL4, IL10, IFN¿ y TNF¿, en concordancia con resultados observados con otras moléculas de esta familia, concretamente sesquiterpenos lactónicos que inhiben la producción de IL8 en la línea tumoral de células epiteliales HeLa. Otros resultados, también obtenidos en diversas líneas tumorales, en este caso de células del sistema inmune, apoyan el efecto supresor de la producción de citoquinas. En este sentido se ha demostrado que sesquiterpenos dímeros aislados de Inula británica inhiben la producción de TNF¿ en RAW264.7, en una línea de macrófagos de ratón. También se han descrito efectos sobre la producción de otras citoquinas como la IL4 en una línea de células leucémicas de basófilos de rata (RBL-2H3) debido al efecto de sesquiterpenos aislados de Thai zedoary. Nuestros resultados son los primeros que analizan el efecto de moléculas de la familia de los heliannósidos en células primarias humanas del sistema inmune. El efecto de estos compuestos sobre las células primarias humanas nos proporciona un cuadro con bastante interés para futuras aplicaciones clínicas puesto que se trata de compuestos orgánicos, con efectividad a una concentración baja (1¿M), y que son capaces de inhibir la activación de linfocitos CD4+ cuando la estimulación de los mismos se hace en presencia de los terpenos. Estos linfocitos se bloquean y son incapaces de progresar en el ciclo celular, de expandirse clonalmente y de producir citoquinas en respuesta a esa estimulación. Además la muerte celular inducida por el tratamiento con estos terpenos se reduce, no superando el 15% en el punto álgido de muerte celular. 2. Efecto de los epoxicurcufenoles sobre células de leucemia El grupo epóxido ha sido foco de investigación de la actividad carcinogénica, mutagénica y citotóxica de compuestos aromáticos y olefínicos desde hace bastante tiempo y se acepta de forma general que los epóxidos son los responsables principales en el enlace irreversible entre hidrocarburos aromáticos y el ADN, ARN y diversas proteinas. Estos compuestos son considerados potencialmente peligrosos debido a su posible interacción con el sistema enzimático de descodificación. Así, se han llevado investigaciones sobre la relación entre la estructura de diferentes epóxidos y su actividad sobre células animales y bacterias, describiéndose variaciones en la actividad dependiendo del numero y tipo de sustituyentes en el anillo oxirano. La formación de aductos entre el ADN y los epóxidos ha quedado demostrada en diferentes estudios, tanto teóricos como experimentales, en los que se evidencia la unión entre el grupo epóxido y las bases guanina y adenina, a través de un ataque nucleofílico Sn2 de los grupos aminos de estas bases sobre el anillo oxirano. Aunque no solo es importante que estos compuestos interactúen con las bases, también es interesante saber si estos productos destruyen la molécula de ADN al distorsionarla, o bien no la distorsionan y producen efectos mutagénicos. Es significativo el estudio realizado sobre la Aflatoxina B1 (AFB1) producida por Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus y Aspergillus nomius, y que es uno de los mutágenos más potentes en la carcinogénesis humana. Esta molécula posee un enlace doble entre los carbonos C-8 y C-9 que es oxidado en el hígado por la enzima citocromo P450, dando exo y endo estereoisomeros. El primero es un compuesto electrofílico que forma aductos por reacción con el nitrógeno en posición 7 de la guanina en el ADN, a diferencia del endo. Los autores realizan la optimización del modelo del complejo ligando-ADN mediante el uso de Macromodel con el parámetro MM2, llegando a la conclusión de que la intercalación en la doble hélice de ADN de moléculas pequeñas poseedoras de un grupo epóxido y un anillo aromático, es un fenómeno importante ya que no distorsiona excesivamente la molécula y no la desestabiliza, y es por ello que tiene una potencial mutageneicidad. Puesto que el grupo epóxido, es conocido por su reactividad como agente alquilante frente a biomoleculas, pareció interesante ensayarlas frente a algún tipo de células animales, en este caso frente a la línea celular Jurkart procedente de una leucemia T CD4+ (American Tissue Cultura Collection), con el fin de estudiar su potencial antiproliferativo. Este tipo de células no necesita ningún tipo de estímulo para proliferar, solo un aporte de nutrientes, lo que facilita el ensayo además de que cualquier efecto no se ve enmascarado por otras situaciones. Los productos ensayados en este experimento, corresponden a tres series que denominamos Serie C4 (HE-14a, HE-14b), Serie C5 (HE-13a, HE-13b, HE-18a, HE-18b, HE-19a, HE-19b, HE-20, HE-21a, HE-21b, HE-22a, HE-22b). Serie C6 (HE-2, HE-4, HE-13a, HE-13b, HE-114, HE-15a, HE-15b, HE-16a, HE-16b, HE-17a, HE-17b) en función del tamaño de la cadena bencílica del epoxicurcufenol ensayado. Se pueden observar varias diferencias fundamentales en la estructura de los compuestos ensayados que pueden trasladarse a sus efectos en este ensayo. Así, las moléculas problema pueden poseer las siguientes modificaciones: uno o dos grupos hidroxilos aromáticos; un grupo metilo en el anillo aromático; la posición bencílica de la cadena lateral estar ramificada con un Metilo o con un Etilo; y un grupo epóxido trialquilado ó monoalquilado. Atendiendo a estas modificaciones analizamos los siguientes puntos: 2.1. Influencia del número de hidroxilos aromáticos en la actividad El análisis de los resultados muestra una clara dependencia entre la actividad y el número de grupos hidroxilos aromáticos de la molécula. Así, podemos observar como los productos con un solo grupo hidroxilo son inactivos, mientras que los que poseen dos, son de forma general, activos. Así se observa cundo se comparan HE-2 y HE-15b y lo mismo ocurre si se comparan HE-4 frente a HE-15a. Con la serie C5 ocurre lo mismo, HE-18a y HE-18b son activos, a diferencia de HE-21a y HE-21b. 2.2. Influencia de la sustitución de la posición C-4 en la actividad La presencia del grupo metilo en el anillo aromático resulta un requerimiento importante para la actividad, como resulta de la comparación de la actividad de HE-13b y HE-2. 2.3. Influencia de la sustitución de la cadena en posición bencílica sobre la actividad. Con respecto al resto alquílico en posición bencílica, la comparación de los efectos de HE-13b, HE-14 y HE-16b, en los que únicamente cambia esa parte de la molécula manteniendo constante el resto, se observa que la actividad se ve mermada por la falta del metilo aromático. Así, HE-16b tiene una actividad mínima al igual que HE-13b, mientras que HE-14 si es activo. Parece que existe un factor estérico en este efecto. Si se comparan ahora la actividad de HE-14, con los cabezas de serie HE-2 y HE-4, que poseen el metilo aromático, se puede predecir, que una molécula con metilo aromático pero sin sustitución en la posición C-7 de la cadena lateral, debe ser aun más activa. Los tres compuestos frente a la población R1, tienen prácticamente la misma actividad, a pesar de que al compuesto HE-14 le falta el metilo aromático, que es un requerimiento que influye en la actividad tal como hemos comentado anteriormente. En la población R2 también ocurre lo mismo, aunque en este caso HE-4 es menos activo que HE-2. 2.4. Influencia de la estereoquímica relativa en la actividad. Este efecto lo podemos evaluar ya que en la colección de epoxicurcufenoles ensayados, excepción hecha del HE-14, que carece de centro quiral en el C-7, son diastereoisómeros, de forma que tenemos compuestos con estereoquímica relativa 7S*10R* y 7R*10R*. El primero poseería un puente de hidrogeno entre el grupo epóxido y el OH aromático más cercano, y el segundo no (de acuerdo a sus datos espectroscópicos y al estudio conformacional teórico realizado previamente. El análisis de los niveles de actividad de los productos que han dado positivo en este ensayo, muestra que siempre es el isómero ¿b¿ el mas activo, que además de ser el isómero más polar, es en dichos casos, el que posee la estereoquímica relativa 7S*10R*. 2.5. Influencia de la sustitución del grupo epóxido en la actividad. Este efecto se puede evaluar por comparación de HE-18a y b y HE-2, HE-4, que son parejas de diastereoisómeros activas que se diferencian únicamente en ese grado de sustitución. En ellos se observa como los diastereoisómeros HE-18 son más activos que los HE-2 y HE-4. Es más, si tenemos en cuenta el efecto de la estereoquímica relativa de la molécula, HE-18b es con diferencia el mejor producto ensayado, inhibe la proliferación y no hay ninguna población celular que eluda a su efecto. 2.6. Requerimientos óptimos para la actividad sobre células de leucemia. Teniendo en cuenta los requerimientos estructurales comentados en los puntos anteriores, se propone como la estructura que pudiera tener mejores resultados en este bioensayo aquella en la que exista un metilo en posición C-4, la ausencia de sustitución en la posición C-7, dos grupos hidroxilos aromáticos en posiciones C-2 y C-5, así como un grupo epóxido en la cadena lateral monosustituido. En el caso de que la posición C-7 estuviera funcionalizada con un grupo alquilo, (aunque no sería la estructura óptima), la estereoquímica relativa más favorable es aquella en la que se forme un puente de hidrogeno entre el OH en posición C-2 y el grupo epóxido. Esta estereoquímica, normalmente es 7S*10R*. Este estudio abre una puerta muy prometedora para el diseño de nuevas moléculas más activas y con mejores perfiles de selectividad. Una segunda aproximación al estudio de Relación Estructura¿Actividad (SAR) con nuevas modificaciones estructurales, como resultado del estudio realizado, nos permitirá avanzar en la identificación de los mecanismos de acción. Todos estos datos hacen de los heliannósidos una futura y potente herramienta terapéutica que permitirá su uso en enfermedades del sistema inmune, tales como autoinmunidad y rechazos a trasplantes sin menoscabar la capacidad de reacción del sistema inmune frente a otro tipo de amenazas como infecciones, que es el principal problema de las actuales terapias inmunosupresoras.