Interacción entre el sistema tiroideo y el sistema de estrés en el lenguado senegalés (Solea senegalensis)

Resumen

1. Introducción y objetivos El lenguado senegalés (Solea senegalensis) es un pez plano de alto valor comercial, cuyo cultivo está extendiéndose en las diversas regiones de la Península Ibérica [7,16]. En los últimos años, debido al gran interés en el cultivo de S. senegalensis, varios estudios se han centrado en diversos procesos fisiológicos de esta especie, incluyendo tanto el sistema tiroideo como el sistema de estrés [2,5,11,23]. Ambos sistemas poseen importantes papeles fisiológicos en los vertebrados, existiendo una clara interrelación entre los mismos. Se ha demostrado que perturbaciones de eje tiroideo debidas a una activación del sistema de estrés, afecta negativamente el desarrollo larvario, incluido el proceso metamórfico, originando una elevada tasa de mortalidad y de malformaciones. Esta situación induce unas importantes pérdidas económicas para las empresas dedicadas al cultivo larvario de la especie [9,12,20]. La producción de las hormonas tiroideas está regulada por el eje hipotálamo-hipófisis-tiroides (HHT). El hipotálamo controla, gracias a la hormona liberadora de tirotropina (TRH), la actividad de las células sintetizadoras de hormona estimulante del tiroides (TSH) a nivel adenohipofisario. La hipófisis libera TSH a la sangre y esta hormona estimula la glándula tiroides para que secrete las hormonas tiroideas (tiroxina [T4] y 3,5,3'-triiodo-L-tironina [T3]). Los efectos genómicos de las hormonas tiroideas están mediados por la T3, producida principalmente vía deiodinización extratiroidal de la T4 (T4-ORD) a través de enzimas 5'-deiodinasas: D1 and D2 (las cuales regularían los niveles circulantes y las reservas tisulares locales de T3, respectivamente). En peces teleósteos, además de la TRH, se ha demostrado que la hormona liberadora de corticotripina (CRH) también regula las células TSH adenohipófisarias [4]. La CRH normalmente induce la respuesta de estrés (eje hipotálamo-hipofisario-interrenal, HHI) activando las células sintetizadoras de la hormona estimulante de las cápsulas adrenales (ACTH) en la hipofisis. Esta hormona estimula el tejido interrenal para liberar el cortisol, principal hormona del estrés [26]. La actividad de la CRH está regulada por la proteína de unión a la CRH (CRH-BP). La CRH presenta una mayor afinidad por la CRH-BP que por su receptor y, por tanto, la CRH-BP es generalmente considerada como un potente antagonista de la CRH. Además, la CRH-BP al unirse a la CRH circulante cumple una función de protección frente a la degradación [14-15,18,24]. La ACTH se origina a partir del precursor peptídico proopiomelanocortina (POMC). La POMC da lugar a varios péptidos a través de procesamiento posttraduccional (dependiendo de la presencia de las enzimas prohormonas convertasas: PC1/3 y PC2) diferentes según el tipo celular estudiado. En las células corticotropas de la pars distalis adenohipofisaria, la PC1/3 corta la POMC para producir la ACTH, la ß-lipotropina (ß-LPH) y el péptido N-terminal. Por el contrario en las células melanotropas de la pars intermedia adenohipofisaria, además de la PC1/3 también está presente la PC2. De este modo, en dichas células la PC2 actúa sobre: i) la ACTH para originar la ¿-hormona estimulante de melanocitos (¿-MSH) y el péptido semejante a la corticotropina del lóbulo intermedio péptido (CLIP); y ii) el péptido ß-LPH para originar la ß-MSH y la ß-endorfina (ß-END) [6]. Existen pocos datos sobre la ontogenia del sistema tiroideo y del sistema de estrés en S. senegalensis, y el desarrollo normal de estos sistemas, aún está por establecerse. Estudios previos han analizado los efectos de distintos factores de estrés sobre el cultivo y diferentes aspectos fisiológicos en S. senegalensis [1,3,5,23]. Sin embargo, hasta ahora el papel preciso del nivel central del eje HHI (i.e. CRH, CRH-BP y POMC) en S. senegalensis aún no ha sido establecido debido a la ausencia de herramientas metodológicas apropiadas. Por otra parte, la información existente sobre la interacción entre la glándula tiroidea y el eje de estrés también es escasa. Además, existen resultados contradictorios sobre la interrelación de los sistemas tiroideos y de estrés en los teleósteos, no pudiéndose establecer un patrón valido para todas las especies [4]. La posibilidad de estudiar el efecto del estrés crónico sobre el sistema tiroideo, o bien de analizar el efecto de una potenciación o inhibición de dicho sistema sobre el sistema de estrés nos permitiría conocer la interrelación existente entre ambos sistemas en el lenguado senegalés. Por lo tanto, los Objetivos Principales de este Tesis Doctoral se subdividen en dos temas principales: i) obtención de nuevas herramientas metodológicas que permitan investigar el eje de estrés a nivel hipotalámico e hipofisario, y ii) analisis de la interrelación entre el eje tiroideo y eje de estrés en larvas y juveniles de S. senegalensis. 2. La caracterización de nuevas herramientas metodológicas claves del eje HHI Las secuencias completas de crh, crh-bp, pomc-a y pomc-b (genes involucrados en el eje de estrés) fueron obtenidas por primeravez en S. senegalensis (NCBI nucleotide database accession numbers: FR745427, FR745428, FR851915 and FR851916 respectivamente). La obtención de estas secuencias nos ha permitido la investigación de la fisiología del sistema de estrés en S. senegalensis a nivel central (hipotálamo e hipofisis) [CAPÍTULOS 2 y 3]. 2.1. La respuesta de estrés: CRH versus CRH-BP Las secuencias, la CRH y la CRH-BP están muy conservadas entre vertebrados [CAPÍTULO 2]. Las secuencias de aminoácidos deducidas de la CRH y la CRH-BP parece ser altamente homólogas a las de otros vertebrados. El péptido maduro de sseCRH, por ejemplo, muestra un alto grado de homología de hasta 72% de identidad con humanos, y el 80% de la tilapia de Mozambique (Oreochromis mossambicus); mientras que la secuencia de aminoácidos de la sseCRH-BP contiene los 10 residuos de cisterna, involucrados en la formación de 5 puentes de cisteína importantes para la actividad de unión del ligando, y muy bien conservados [10]. En el CAPÍTULO 2 y 6 se ha investigado el papel de la CRH y la CRH-BP en la respuesta al estrés crónico y agudo. En juveniles de S. senegalensis, la alta densidad de cultivo parece evocar un estrés crónico, visualizado por una expresión de la crh ligeramente elevada así como por altos niveles plasmáticos de cortisol. Sin embargo, la expresión de la crh-bp no se vio afectada [CAPÍTULO 2]. En post-larvas de S. senegalensis, el ayuno induce un estrés crónico, también visualizado por un aumento en los niveles de cortisol plasmático y por una expresión elevada de la crh, así como por una disminución de la expresión de la crh-bp [CAPÍTULO 6]. Es interesante resaltar como cuando los especímenes bajo un estrés crónico fueron sometidos a un posterior estrés agudo (una transferencia hiperosmótica) los niveles de expresión de la crh y valores plasmáticos de cortisol no se vieron afectados [CAPÍTULO 2]. Sin embargo, la capacidad osmoregulatoria estaba perturbada, lo que indica que los animales no fueron capaces de hacer frente al estrés posterior debido a la transferencia osmótica. Esto indica que en altas densidades, los peces están sufriendo una situación alostática, que podría tener efectos negativos sobre el crecimiento, el sistema inmunológico, y bienestar de los animales [CAPÍTULO 2]. Hasta el momento, el papel de la CRH-BP en la adaptación al estrés crónico no ha sido abordado en los teleósteos. Los niveles de expresión de la crh-bp se redujeron ligeramente en post-larvas de S. senegalensis sometidas a un estrés crónico por ayuno [CAPÍTULO 6]. Sin embargo, no se apreciaron cambios significativos en la expresión de la crh-bp cuando juveniles de S. senegalensis fueron expuestos a un estrés crónico por alta densidad durante un mes [CAPÍTULO 2]. Por otra parte, los niveles de expresión de la crh-bp aumentaron inmediatamente después de un estrés agudo (transferencia al alta salinidad) independientemente de si el animal estaba previamente sometido a un estrés crónico o no. Por otro lado, los niveles de cortisol plasmático, así como la expresión de la crh aumentaron tras el estrés crónico, pero se mantuvieron estables en los peces con estrés crónico sometidos a un posterior estrés agudo [CAPÍTULO 2]. Esto podría indicar, que el cortisol y la CRH por sí solos, no siempre son los parámetros más adecuados para determinar una respuesta de estrés en teleósteos, en este caso en S. senegalensis. Los niveles de expresión de la crh-bp se elevan en juveniles de S. senegalensis después de un estrés agudo [CAPÍTULO 2], sugiriendo que la CRH-BP juega un papel en la regulación homeostática del estrés mediante la regulación de la actividad de la CRH [CAPÍTULO 2]. El aumento de los niveles de la CRH-BP puede amortiguar el incremento de los niveles de la CRH (y consecuentemente de cortisol) y recuperar rapidamente de nuevo los niveles basales. Por lo tanto, las situaciones de estrés agudo inducen incrementos muy pronunciados pero cortos en el tiempo de los niveles plasmáticos de cortisol en diversas especies, incluida S. senegalensis [5,21-22]. Sin embargo, durante las situaciones de estrés crónico el eje HHI presenta una menor intensidad de respuesta, pero con una mayor duración en el tiempo. De ese modo, el incremento de la actividad de la CRH mantiene los niveles de cortisol ligeramente elevados durante la exposición a un estrés crónico. En este caso, el efecto antagonista de la CRH-BP no es necesario, lo que explicaría la ausencia o la existencia de una ligera disminución de sus niveles de expresión en las situaciónes de estrés crónico. Por lo tanto, al menos en S. senegalensis, la CRH-BP, y no la CRH, es probablemente el modulador de la respuesta al estrés agudo, pero no así en la respuesta al estrés crónico. Nuestros resultados indican como la secuencia de los factores de estrés es un factor determinante para la activación de genes tales como la crh y la crh-bp en S. senegalensis [CAPÍTULOS 2 y 6]. 2.2. POMC En nuestro estudio dos formas del gen de POMC han sido descritas por primera vez en S. senegalensis [CAPÍTULO 3]. El péptido precursor, POMC se puede escindir originado una serie de péptidos con funciones en diversos procesos fisiológicos tales como la regulación de la respuesta al estrés y de la pigmentación. En S. senegalensis, los papeles de las hormonas derivadas de la POMC se distribuyen entre los dos genes de POMC, y muestran una tendencia hacia la subfuncionalización de estos parálogos [CAPÍTULO 3]. La expresión diferencial de ambos transcritos (ssePOMC-A y B ssePOMC) tras una respuesta de estrés crónico, también indican diferentes funciones fisiológicas de cada paralogo, lo cual es muy importante en la investigación de la función de POMC en las respuestas endocrinas. El beneficio de una regulación más simple, por ejemplo, con un parálogo sin una ß-END funcional, se elimina los efectos secundarios de ß-END cuando sólo la producción de MSH es necesario, y esto puede haber impulsado la subfunctionalización entre las dos copias de POMC. Especializaciones de POMC también se han encontrado en otros vertebrados, lo que sugiere una tendencia evolutiva hacia una forma diferente de péptidos POMC regulación [6]. En el linaje de los teleósteos, sin embargo, estas especialidades son el resultado de la duplicación del genoma 3R específica de peces, mientras que lo más probable es que los parálogos de S. senegalensis POMC sean el resultado de una duplicación mucho más reciente [CAPÍTULO 3]. 3. Determinación de la interrelación entre los ejes HHT y HHI 3.1. Desarrollo del sistema tiroideo Para determinar la interrelación entre el eje tiroideo y el eje de estrés en juveniles y post-larvas de S. senegalensis, nuestro estudio se ha centrado en: i) los efectos del estrés sobre el sistema tiroideo, y ii) la influencia de las hormonas tiroideas en el eje de estrés [CAPÍTULOS 4 y 6]. Previamente a estos estudios, se ha establecido la ontogenia normal del sistema tiroideo durante el desarrollo larvario y metamorfosis de S. senegalensis [CAPÍTULO 5]. Nuestros resultados han demonstrado que los folículos tiroideos en larvas (y juveniles) de S. senegalensis sólo se encuentran en el área subfaringe. También, existe un incremento de niveles de T3 y T4 durante el climax de la metamorfosis. Los resultados obtenidos del análisis de los cambios del sistema tiroideo han demostrado que los folículos tiroideos se activan para prepararse para el proceso metamórfico; es decir, existe una evidente cronología en la activación de la glándula tiroidea asociada a la metamorfosis, que ya empieza en los estadios premetamórficos [CAPÍTULO 5]. Los resultados proporcionan interesante información sobre el proceso de metamorfosis en esta especie, y serán de gran valor para futuros experimientos. 3.2. Centrándose en el nivel central Para establecer los efectos del estrés sobre el sistema tiroideo, así como la influencia de las hormonas tiroideas sobre el eje de estrés a un nivel central, juveniles de S. senegalensis fueron inyectados con cortisol, T4 o T3 [CAPÍTULO 4]. No se observaron diferencias en la expresión de la crh después de los tratamientos con T4 o T3, y no está claro si la CRH presenta una función tirotrópica en S. senegalensis [CAPÍTULO 4]. Además el tratamiento con cortisol tampoco afectó la expresión de la crh [CAPÍTULO 4]. La falta de una adecuada respuesta de la CRH también se observó cuando ejemplares de S. senegalensis, sometidos a un estrés crónico fueron expuesto a un posterior estrés agudo, sugiriendo que la CRH-BP es el modulador más importante de la respuesta al estrés agudo en esta especie [CAPÍTULO 2]. El incremento del nivel de expresión de la crh-bp en los juveniles de S. senegalensis inducido por el tratamiento con T4 indica que la hormona tiroidea inhibe el eje HHI a nivel central. Estos resultados también demuestran que la CRH-BP, y no la CRH, funciona como un potente modulador de los ejes HPI y HPT [CAPÍTULO 4]. Post-larvas de S. senegalensis sometidas a condiciones de ayuno presentan elevados niveles de cortisol y de expresión de la crh así como una disminución en la expresión de la crh-bp, lo que indica que estos especimenes muestran una respuesta de estrés crónico [CAPÍTULO 6]. Como se mencionó anteriormente en el CAPÍTULO 2, estas condiciones son típicas de S. senegalensis en situaciones de estrés crónico. El ayuno también induce una disminución en las concentraciones de T3, pero, sorprendentemente, no se observa ningún cambio en la expresión de la subunidad ß de la tsh [CAPÍTULO 6]. En los juveniles de S. senegalensis, se ha demostrado que el tratamiento con T4 o T3 origina una disminución significativa en la expresión de la subunidad ß de la tsh, mientras que la actividad enzimática de T4-ORD (responsable de paso de T4 a T3) se mantuvo estable. Estos resultados sugieren que los niveles sistémicos de las hormonas tiroideas se regulan principalmente a través de la retroalimentación negativa a nivel central (hipotálamo e hipofisis), y no a nivel periférico (órganos diana, i.e. higado, branquias, riñón, etc.) [CAPÍTULO 4]. En el caso del ayuno, la disminución en los niveles de T3 podría explicarse por alteraciones de las actividades ORD periféricas. Es plausible que estas alteraciones sean el resultado de la activación del eje HHI, con el consiguiente incremento en los niveles de cortisol. Se sabe que el cortisol presenta un efecto antagonista sobre los niveles de la hormona tiroidea. En S. senegalensis, una relación inversa entre el cortisol y la concentración de T4 plasmática se observó en especimenes sometidos a cambios bruscos de salinidad que incrementan significativamente los niveles de cortisol plasmáticos [2]. Hasta el momento, los efectos del cortisol sobre las concentraciones de TSH no han sido establecidos. En juveniles de S. senegalensis, la administración de cortisol estimula la expresión de la subunidad ß de la tsh. Es posible que el aumento de la expresión de la subunidad ß de la tsh aumenta la producción de T4 y así mismo aumenta la activiad de T4-ORD por la presencía de una mayor concentración de substrato. En este modo, el animal mantiene los niveles de las hormonas tiroideas dentro los niveles de la homeostasis. Por lo tanto, los niveles de T4 libre en plasma no aumentaron, y, finalmente, se obeservó una disminución después del tratamiento con cortisol [CAPÍTULO 4]. Por otro parte, es interesante para mencionar que en la aplicación clínica, un aumento en los niveles de TSH plasmática indica que una persona sufre de hipotiroidismo. Se supone que los niveles de TSH suben para compensar la falta de la producción de las hormonas tiroideas. Es posible, que el aumento en los niveles de la expresión de la subunidad ß de la tsh inducida por cortisol indica que en otro nivel del sistema tiroideo hay una inhibición que reduce la disponibilidad de las hormonas tiroideas. El incremento en los niveles de cortisol causado por el ayuno en post-larvas de S. senegalensis podría reducir las concentraciones de T3 totales por cambios en la actividad deiodinasa sin cambiar los niveles de TSH. Estos resultados sugieren claramente que el estrés crónico inducido por la situación de ayuno está inhibiendo el sistema tiroideo en post-larvas de S. sengalensis [CAPÍTULO 6]. 3.3. Significado fisiológico Nuestros resultados plantean interesantes cuestiones: ¿por qué / para qué existe una interacción entre el sistema tiroideo y el sistema de estrés?. La respuesta no está en el viento [Bob Dylan, 1962] sino que debemos buscarla en que los ejes HHT y HHI están íntimamente implicados tanto en el metabolismo, como en el consumo de energía, siendo estos dos procesos esenciales en la respuesta al estrés [26]. La función general de una respuesta de estrés es preparar el organismo para luchar o huir y para ello se estimula la redistribución de la energía mediante la movilización de la glucosa, así como la movilización de los ácidos grasos y el catabolismo de proteínas y grasas para incrementar la gluconeogénesis [17,26]. Por el contrario, el sistema tiroideo está más involucrado en los procesos anabólicos, tales como el crecimiento y una fuerte reacción en las diferencias en el estado nutricional [8,25]. De hecho, el tratamiento con T4 y T3 induce una disminución de los niveles de la glucosa y triglicéridos plasmáticos en juveniles de S. senegalensis, lo que indica el efecto estimulador de estas hormonas sobre el metabolismo [CAPÍTULO 4]. Sin embargo, los niveles plasmáticos de glucosa son elevados en juveniles estresados, y en post-larvas de S. senegalensis bajo situaciones de ayuno los procesos catabolizantes, medidos por la disminución del contenido de carbono y nitrógeno, están estimulados [CAPÍTULO 6]. Es obvio que la única manera en que los organismos heterótrofos pueden obtener energía es a través de la ingesta de alimentos. Por este motivo la ingesta de alimentos está estrictamente regulada, y las situaciones de ayuno e inanición inducen una serie de procesos fisiológicos para preservar la homeostasis energética en los animales [13,19]. El sistema tiroideo responde a una amplia gama de variables ambientales vinculados a la activación de los estados anabólicos, que podría explicar la inhibición en condiciones de estrés catabólico o causado por las hormonas tiroideas, así como los efectos inhibidores del cortisol en el sistema tiroideo [8]. Por lo tanto, es plausible que una respuesta adecuada de un animal a una situación de ayuno deba, necesariamente implicar acciones coordinadas entre el cortisol y las hormonas tiroideas, hormonas que representan respectivamente los productos finales de los ejes HHI y HHT, que son, básicamente, los dos ejes más importante que participan en el metabolismo energético. Nuestros datos obtenidos en post-larvas de S. senegalensis sugieren que el sistema de estrés inhibe los procesos anabólicos a través de la inhibición del sistema tiroideo, y podría explicar la capacidad de respuesta de las hormonas tiroideas al estrés causado por el ayuno [CAPÍTULO 6]. Las funciones contradictorias del sistema tiroideo y el sistema de estrés en el gasto de energía probablemente no son compatibles, al explicar el efecto inhibidor del uno hacia el otro. Referencias [1] C. Aragão, J. Corte-Real, B. Costas, M.T. Dinis, L.E. Conceição, Stress response and changes in amino acid requirements in Senegalese sole (Solea senegalensis Kaup 1858), Amino Acids(2007). [2] F.J. Arjona, L. Vargas-Chacoff, M.P. Martín del Río, G. Flik, J.M. Mancera, P.H.M. Klaren, The involvement of thyroid hormones and cortisol in the osmotic acclimation of Solea senegalensis, Gen. Comp. Endocrinol. 155 (2008) 796-803. [3] F.J. Arjona, L. Vargas-Chacoff, I. Ruiz-Jarabo, M.P. Martín del Río, J.M. Mancera, Osmoregulatory response of Senegalese sole (Solea senegalensis) to changes in environmental salinity, Comp. Biochem. Physiol. A 148 (2007) 413-421. [4] N.J. Bernier, G. Flik, P.H.M. 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