Desarrollo y validación de un sistema de detección y tipificación de papilomavirus humano

Resumen

El Virus del Papiloma humano (VPH) está asociado a lesiones benignas, pre-invasivas e invasivas en diferentes localizaciones. Actualmente se reconocen más de 100 tipos de VPH, de ellos 40 infectan el tracto anogenital humano. De acuerdo a su oncogenicidad cervical, 15 han sido clasificados de alto riesgo para desarrollar cáncer cervical, 3 han sido clasificados como de probable alto riesgo, 12 como de bajo riesgo y 3 como de riesgo indeterminado. Los tipos de alto riesgo, fundamentalmente el 16 y el 18, son considerados agentes etiológicos del Cáncer de Cérvix Uterino (CCU). Los resultados de diferentes estudios epidemiológicos realizados a nivel mundial han aportado datos interesantes acerca de la contribución de estos virus al desarrollo del CCU y el comportamiento de diferentes factores de riesgo en las diferentes áreas geográficas; lo que ha permitido establecer las directrices para contribuir desde el cribado y la vacunación, a disminuir las altas tasas de incidencia y mortalidad por CCU. Los nuevos algoritmos de cribado propuestos contemplan la detección molecular del VPH como primer paso. Cuba pertenece al área geográfica de América latina y el Caribe, donde esta enfermedad cobra miles de vidas femeninas anualmente. Los sistemas comerciales disponibles en la actualidad para la detección y tipado de VPH son caros no estando al alcance de los países en vías de desarrollo. Por tal razón, nos propusimos: 1. Desarrollar un sistema de genotipado de VPH mediante técnicas de Biología Molecular, basado en la basado en la detección de ADN vírico por un sistema de PCR e hibridación reversa, con sensibilidad y especificidad adecuadas para el diagnóstico molecular pero con un coste inferior a los sistemas comerciales para su posterior utilización en estudios poblacionales de la infección por VPH en Cuba. 2. Validar el sistema desarrollado empleando técnicas de genotipado comerciales en muestras positivas y negativas al VPH. Para su desarrollo y optimización se emplearon sondas de VPH (6, 11, 16, 18,31,33,45, 51, 52 y 59), los clones de VPH (6, 11, 16, 18,31,39,45 y 51). En la validación posterior del sistema se emplearon 176 muestras positivas y 120 muestras negativas a VPH, todas analizadas por el sistema comercial de detección de VPH, Captura de Híbridos 2. Todas las muestras positivas, así como aquellas negativas que amplificaron con la PCR (Gp5+/6+) fueron genotipadas por el Sistema de Genotipado Experimental (SGE) y comprobados por el sistema comercial HPV Genotyping Linear Array (Roche). En cumplimiento de los objetivos propuestos concluimos que: se diseñó un nuevo sistema de genotipado basado en la hibridación reversa, que emplea los primer generales Gp5+/6+ marcados con biotina. La tira reactiva fabricada contiene 11 tipos de VPH, 9 especialmente prevalentes y responsables del cáncer de cérvix y 2 de bajo riesgo. La sensibilidad de la tira se encuentra entre 1 y 1000 copias según el genotipo analizado. Los estudios intraensayo e interensayo mostraron una reproducibilidad del 100%, no se encontraron reacciones cruzadas entre genotipos. Los niveles de detección de los geotipos de alto riesgo más prevalentes fue excelente. Por ello este método puede ser útil en los estudios epidemiológicos realizados en países en desarrollo donde la infección por VPH es una amenaza a la salud de la mujer.