Estudios genéticos y de biología reproductiva en orobanche cumana wallr

Resumen

El girasol (Helianthus annuus L.) es uno de los cultivos oleaginosos anuales más importantes a nivel mundial. El jopo de girasol (Orobanche cumana Wallr.) es una planta angiosperma holoparásita que penetra en los tejidos vasculares de las raíces del girasol y obtiene de ellos tanto el agua como los nutrientes necesarios para completar su ciclo vital, constituyendo una importante limitación fitopatológica del rendimiento del girasol en España y en la mayor parte de los países del sur y este de Europa y Oriente Medio. Dentro del sistema girasol-jopo de girasol, la mayoría de los estudios se han centrado en el huésped, en concreto en la identificación de fuentes de resistencia genética y el estudio del modo de herencia de dichas fuentes, siendo los estudios acerca del parásito muy escasos. Esta es la razón fundamental que motiva la realización del estudio que planteamos, la de arrojar luz en lo que se refiera a la biología y genética del parásito, para así poder ampliar conocimientos acerca de la interacción huésped-parásito con el objetivo final de desarrollar de manera más eficiente sistemas de control integral y sostenible de esta planta parásita. El jopo de girasol es una planta parásita que puede producir grandes pérdidas de rendimiento en girasol. El jopo se ha controlado tradicionalmente mediante el uso cultivares de girasol resistentes. La resistencia a jopo en girasol sigue en general el modelo gen a gen y está controlada por alelos dominantes en un locus (Pérez-Vich et al., 2013). Esto determina la existencia de razas fisiológicas en jopo frente a las que proporcionan resistencia a genes mayores del girasol. El uso recurrente de un reducido número de fuentes de resistencia vertical ha dado lugar a la continua aparición de nuevas razas de jopo y en consecuencia, a la necesidad de identificar e introgresar nuevos genes de resistencia en girasol. Esto ha centrado la mejora de girasol en resistencia a jopo en detrimento de caracteres agronómicos o de calidad. Alternativamente, las empresas de semillas están apostando por el uso de tolerancia no transgénica a herbicidas para el control de jopo. El uso de resistencia genética es preferible desde un punto de vista de sostenibilidad agrícola, pero requiere de nuevas estrategias para asegurar su eficacia y durabilidad. Entre las mismas se precisa un conocimiento profundo de la biología y los mecanismos y genética de la virulencia en el parásito. El sistema reproductivo de una planta parásita determina su grado de diversidad genética y la distribución de la misma (Satovic et al. 2009). La mayoría de especies de Orobanche son polinizadas por insectos, si bien algunas otras especies son autógamas (Musselman et al. 1981, Kreutz 1995). El jopo del girasol es considerado una especie predominantemente autógama si consideramos la morfología de la flor (Satovic et al. 2009), aunque no existen hasta la fecha estudios más concretos acerca de su tasa de polinización cruzada. La virulencia de poblaciones de O. cumana relacionada con las fuentes de resistencia disponibles en girasol fue estudiada en Rumanía a finales de la década de 1970. Vrânceanu et al. (1980) identificaron cinco razas de la planta parásita, A a E, de virulencia progresivamente mayor en girasol y controladas, respectivamente, por cinco genes mayores de resistencia, Or1 a Or5, responsables de resistencia acumulativa y dominante. Las razas B y C fueron identificadas en aquel momento en España (González-Torres et al., 1982) además de poblaciones de O. cumana de virulencia mayor respecto a las descritas en Rumanía (Melero-Vara et al., 1989, 2000). Además, la raza F, que supera el gen de resistencia Or5, fue identificada en España a mediados de la década de 1990 (Alonso et al., 1996; Domínguez et al., 1996), encontrándose resistencia a esta raza tanto en girasol silvestre como cultivado (Sukno et al., 1999; Fernández-Martínez et al., 2000). La presencia de nuevas razas de jopo de girasol plantea la posibilidad de estudiar la herencia de la virulencia / avirulencia del jopo ya que se puede contar con poblaciones de jopo perfectamente identificables mediante su interacción con plantas de girasol de reacción diferencial debido a la presencia de diferentes genes de resistencia. 2. Contenido de la investigación El objetivo general de esta Tesis Doctoral es profundizar en la biología y genética del jopo de girasol mediante la realización de estudios genéticos y de biología reproductiva en dicha planta parásita. Para ello, se llevarán a cabo los siguientes objetivos específicos: Objetivo 1: Desarrollo de metodologías, protocolos y procedimientos para manejo de jopo en estudios genéticos y de biología reproductiva. En concreto, este objetivo persigue (i) determinar si el jopo de girasol tolera o no la autofecundación, (ii) poner a punto un método fiable para embolsar plantas de jopo y conseguir el aislamiento deseado sin que este afecte a la viabilidad de las semillas originadas, y (iii) determinar el efecto de la emasculación y polinización con polen externo en la producción, viabilidad e infectividad de las semillas de jopo. Para determinar la tolerancia a la autofecundación, tipo de bolsa óptima para aislamiento, producción de semillas en asilamiento y realización de cruzamientos, se emplearon diferentes tipos de bolsas de aislamiento, siguiendo la metodología descrita por Pickering (1982), y se comprobó su efecto sobre la producción de semillas, tanto en jopos no emasculados, emasculados y emasculados y polinizados. Se estudió, en caso de producirse, si las semillas obtenidas por aislamiento (autofecundación en un caso y fecundación cruzada en otro) son viables o no y si mantienen intacta o no su capacidad infectiva. La bolsa seleccionada pasó unos controles de calidad para comprobar su absoluta efectividad como barrera de aislamiento frente al polen externo. Objetivo 2: Estudio genético de la ausencia de pigmentación en jopo de girasol. Desarrollaremos este estudio genético a partir de un jopo sin pigmentación aparecido en la naturaleza de modo espontáneo y aislado por el grupo de Investigación. Este fenotipo es fácilmente reconocible por su coloración amarillenta vs individuos normales (pigmentación de azul a violácea). Este estudio será crucial para contrastar la metodología y la técnica aplicada a la hora de embolsar, emascular, cruzar de forma dirigida individuos con y sin pigmentación, y determinar la herencia de este carácter morfológico, útil como marcador fenotípico. Para realizar el estudio genético del carácter “ausencia de pigmentación” en jopo de girasol, inicialmente se autofecundaron poblaciones de jopos amarillos y de jopos pigmentados para desarrollar líneas homogéneas. Se realizaron cruzamientos recíprocos entre “jopos amarillos” y jopos normales pigmentados, según la metodología desarrollada dentro del objetivo 1, y se evaluarán fenotípicamente las generaciones de planta F1, F2 y F3 mediante inoculación de la semilla correspondiente en una línea de girasol muy susceptible. Los test se realizaron bajo condiciones controladas en cámaras de crecimiento de plantas, o bien en invernaderos. Objetivo 3: Determinar la tasa de polinización cruzada entre jopos en condiciones naturales, con el fin de profundizar en el conocimiento de su sistema reproductivo. En estos tres primeros objetivos se empleó el carácter “ausencia de pigmentación” como un marcador fenotípico de fácil evaluación visual para determinar la tasa de polinización cruzada. Para ello se llevó a cabo dos experimentos. El primero se realizó en campo y el segundo en macetas. En ambos casos se emplearon plantas de girasol inoculadas con jopos pigmentados y no pigmentados, sembradas de tal forma que una planta de jopo amarillo quede rodeada por completo de plantas de jopo normal pigmentado. La tasa de polinización cruzada se determinó a partir del cómputo de heterocigotos (individuos verdosos) en la descendencia de los jopos amarillos. Objetivo 4: Estudio genético de la virulencia / avirulencia en jopo de girasol. Siempre y cuando la fiabilidad de la metodología desarrollada en los capítulos anteriores lo permita, realizaremos estudios genéticos de la avirulencia, mediante cruzamientos entre individuos de jopo no capaces (raza E) y capaces (raza F) de infectar al girasol con el gen de resistencia Or5, y posterior análisis de las generaciones F1 y F3. Inicialmente, se desarrollarán líneas puras de jopos de razas E y F. Una vez desarrolladas, se procedió a realizar cruzamientos recíprocos entre individuos de raza E y F para producir la generación de semilla F1 y a partir de ella se originarán familias F3. Tanto semillas F1 como semillas de familias F3 se evaluarán mediante inoculación en la línea de girasol P-1380 (línea diferencial) con el fin de establecer si son o no capaces de infectar plantas de girasol portadoras del gen de resistencia frente a raza E, Or5, así como en una línea de girasol susceptible universal (B117 o similar), con el objetivo de determinar la capacidad infectiva de cada familia, de forma que sólo se tendrán en cuenta los resultados sobre la línea diferencial NR5 de aquellas familias F3 de jopo que presenten infección en B117. El estudio de avirulencia / virulencia en poblaciones de O. cumana se establecerá por estudio estadístico generado por chi-cuadrado comparando la bondad del ajuste entre lo esperado y lo observado entre las tasas fenotípicas para avirulencia / virulencia de los genotipos F2, determinados a través de la evaluación de sus correspondientes familias F3. 3. Conclusión 1.- Orobanche cumana Wallr. tolera bien la autofecundación mediante embolsado de plantas antes de la floración. 2.- El tipo de bolsa empleada para el aislamiento tiene efectos significativos sobre el desarrollo de las plantas y sobre la cantidad, calidad y capacidad infectiva de las semillas producidas. De los tres tratamientos de embolsado empleados (bolsas de papel de color blanco o marrón y bolsas de plástico micro-perforado), únicamente el embolsado con plástico micro-perforado no presentó diferencias significativas en comparación con las plantas control no embolsadas. Esto indica que la luz y unas buenas condiciones de aireación son clave para la producción de semillas de buena calidad en esta especie. 3.- En experimentos de emasculación manual, las bolsas de papel blanco o de plástico micro-perforado resultaron ser un aislamiento eficaz frente al polen externo de jopo, ya que plantas aisladas y emasculadas no produjeron semilla. Las plantas control emasculadas y no embolsadas produjeron un 6.5% de ovarios fertilizados, lo que sugirió la existencia de polinización cruzada en esta especie. 4.- Los experimentos de hibridación controlada de plantas de jopo producen semillas viables, lo que indica que los órganos reproductores femeninos no resultan alterados al manipularse las flores durante la emasculación y fertilización manual. Además, el tipo de bolsa empleada para el aislamiento de plantas afecta el porcentaje de ovarios fertilizados, siendo éste significativamente mayor cuando se emplean bolsas de plástico micro-perforado. (Rodríguez-Ojeda, et al, 2010) 5.- Se ha aislado un mutante natural de O. cumana con ausencia de pigmentación antociánica, que presenta color amarillo del tallo y flores blancas. Mediante cruzamiento con una línea de plantas pigmentadas y estudio de las generaciones F1, F2 y F3, se ha concluido que la ausencia de pigmentación es un carácter parcialmente recesivo determinado por un único gen, denominado Pg. Las plantas heterocigotas para este gen presentan un fenotipo intermedio fácilmente reconocible visualmente. 6.- El grado de virulencia de familias F3 procedentes de plantas F2 homocigotas dominantes o recesivas para el gen Pg no fue significativamente diferente, indicando que la ausencia de pigmentación no tiene efecto alguno sobre la capacidad infectiva del jopo. 7.- La herencia simple del carácter ausencia de pigmentación y la fácil identificación visual de los tres genotipos para el gen Pg posibilita su uso como marcador visual en diversos tipos de estudios. 8.- Se ha demostrado por primera vez en O. cumana la utilidad del uso de las técnicas de hibridación controlada para el desarrollo de poblaciones segregantes en esta especie, necesarias para futuros estudios genéticos y moleculares. (Rodríguez-Ojeda, et al, 2011) 9.- Se ha estimado la tasa de polinización cruzada en O. cumana en experimentos realizados en condiciones de campo y en macetas en los que plantas individuales de jopo no pigmentado se desarrollaron rodeadas de jopos pigmentados. El estudio de la progenie de las plantas no pigmentadas permitió identificar la presencia de plantas híbridas, que promediaron un 28.8% del total de la progenie en condiciones de campo y un 21.5% en macetas. 10.- En el transcurso de los experimentos de polinización cruzada, se observó la presencia de insectos polinizadores de la familia Halictidae (Hymenoptera) en el interior de flores de plantas no pigmentadas, lo que sugiere su posible papel en la polinización cruzada de esta especie. 11.- Considerada hasta la fecha como una especie estrictamente autógama, la presencia de una cierta tasa de polinización cruzada en O. cumana debe ser tenida en cuenta para la obtención de líneas puras y aislamiento de genotipos. Asimismo, la existencia de polinización cruzada debe considerarse para entender aspectos como estructura de poblaciones y evolución racial en esta especie. (Rodriguez-Ojeda et al, 2013a ) 12.- La herencia de la avirulencia / virulencia en O. cumana se ha determinado realizando cruzamientos entre líneas de jopo clasificadas raza E y raza F de jopo, respectivamente, desarrolladas por autofecundaciones sucesivas de plantas individuales durante tres generaciones. 13.- El estudio de la reacción de virulencia / avirulencia de las generaciones F1 y F3 de O. cumana procedentes de los cruzamientos entre ambas razas sobre una línea diferencial de girasol portadora del gen Or5, que confiere resistencia a raza E pero no a F, permitió determinar que la avirulencia en este cruzamiento es dominante y está controlada por un único gen, denominado AvrOr5. 14.- Los resultados confirman a nivel de la planta parásita la relación gen-a-gen en la interacción girasol-O. cumana, en el caso particular del gen Or5 en girasol y el gen AvrOr5 en O. cumana. (Rodriguez-Ojeda et al, 2013b )