Revalorización de excedentes de fresa. Biotransformación de su contenido en glucosa a ácido glucónico mediante gluconobacter japonicus

Resumen

1. Introducción o motivación de la tesis La generación de excedentes y residuos agroindustriales es un problema muy habitual en países desarrollados. La problemática se agrava si nos referimos, por ejemplo, al caso de excedentes de productos perecederos. Entre los principales aspectos negativos que se podrían citar, cabe destacar la utilización no sostenible que se hace de recursos naturales, afectando de modo muy negativo a nuestra capacidad de garantizar las producciones futuras. Dependiendo de la zona geográfica, se pueden encontrar múltiples ejemplos; en España, son especialmente importantes los excedentes de frutas y verduras, y una fruta que destaca en este contexto, por su carácter perecedero y niveles de producción, es la fresa. La producción española se concentra en Andalucía, donde el cultivo de la fresa se ha consolidado como sector estratégico y motor de desarrollo económico en la zona de Huelva. No obstante, el deterioro acelerado de este producto, el carácter estacional de las cosechas y otros aspectos, entre los que se podría citar los estrictos estándares estéticos impuestos para su comercialización, dan lugar a un excedente que, aunque de buena calidad desde el punto de vista nutricional y sanitario, difícilmente encuentra salida en el mercado. En la actualidad, una parte importante de estos excedentes se destina a la elaboración de purés que se usan en otras industrias alimentarias. Los purés, una vez pasteurizados, se mantienen refrigerados; de este modo, además de prolongar la vida útil del producto, se conservan, en gran medida, las propiedades sensoriales y nutricionales de la fresa original. Aunque los excedentes de fresa están siendo aprovechados en la forma comentada, su composición hace de estos concentrados, sustratos naturales con un alto potencial para el desarrollo de productos de mayor valor añadido, especialmente cuando se emplean etapas de biotransformación. De entre las muchas posibilidades que podrían haber sido consideradas para aprovechar y revalorizar este tipo de recursos, la presente memoria de Tesis Doctoral se centra en el estudio de algunos aspectos fundamentales para el desarrollo de procesos fermentativos orientados a la producción de un fermentado glucónico, resultado de la oxidación selectiva, mediante Gluconobacter japonicus CECT 8443, de la glucosa a ácido glucónico. El producto final, con la acidez del ácido glucónico y el dulzor proveniente del contenido residual en fructosa, se podría emplear, como componente base, en la producción de una nueva generación de bebidas fermentadas no alcohólicas, aromáticas, refrescantes y endulzadas, de forma natural, por la fructosa que prevalece en el medio. Aunque este fermentado glucónico de fresa es un medio complejo, el principal compuesto que se pretende obtener en la biotransformación es el ácido glucónico, un aditivo de interés y creciente demanda en farmacología, industria textil, construcción, y especialmente, en alimentación, debido a los potenciales efectos beneficiosos que parece poseer para la salud humana. 2. Contenido de la investigación Para valorar y justificar debidamente esta propuesta, la presente memoria ofrece, en primer lugar, una revisión de las principales propiedades, aplicaciones, métodos de producción del ácido y sus derivados, especialmente los biotecnológicos, así como un análisis crítico y actualizado de los últimos avances que han podido y/o podrían contribuir a la mejora de la producción de este compuesto: viabilidad en el uso de diferentes excedentes agroindustriales como materia prima, desarrollo de procesos biotecnológicos que consideren, tanto el uso de células (hongos y bacterias) como de enzimas aisladas de los anteriores, y el interés que tendría el empleo de microorganismos genéticamente modificados en la optimización de los procesos existentes y en el desarrollo de otros nuevos. Sin embargo, diversos aspectos complican el problema. Por un lado, se ha de hacer referencia a la complejidad del metabolismo de este tipo de bacterias y a la dificultad que presentan para su cultivo en medios sólidos con el objetivo de su conservación, aislamiento y preparación de inóculos. Por otro lado, no sólo se ha de trabajar con un medio complejo, como es el puré de fresa, sino que, además, con la finalidad de conservar, en la medida de lo posible, las propiedades organolépticas y nutricionales de la fresa original, es conveniente trabajar con purés pasteurizados en lugar de esterilizados; sin embargo, esto implica la presencia de otros microorganismos (fundamentalmente, levaduras) que, tras un periodo necesario para su reactivación, pueden competir por los azúcares disponibles en el medio de cultivo. Teniendo en cuenta lo anterior, y trabajando siempre a escala de laboratorio, se hizo necesario: 1º.- Estudiar la preparación del inóculo de G. japonicus CECT 8443 que garantizara su imposición frente a la posible actividad de levaduras. 2º.- Las dificultades para conseguir el crecimiento en placa de G. japonicus CECT 8443 así como la presencia de sólidos en suspensión en el medio, hizo también necesario estudiar la posibilidad de evaluar, de forma indirecta, parámetros cinéticos fundamentales para el diseño de los correspondientes biorreactores. 3º.- Dada la complejidad del metabolismo de la bacteria y su capacidad para seguir transformando el ácido glucónico, se estudió el efecto de la disponibilidad de sustrato sobre la estabilidad del ácido obtenido. 3. Conclusiones Los resultados obtenidos en los estudios sobre el procedimiento para la preparación del inóculo han mostrado cómo, en condiciones de crecimiento óptimas, sin necesidad de controlar el pH del medio, la cepa inoculada posee una capacidad altamente selectiva para convertir glucosa en ácido glucónico, conservando el contenido original en fructosa del puré. Sin embargo, y a pesar de que los inóculos cultivados exclusivamente en medios sintéticos resultan ser eficientes para lograr la conversión deseada, es recomendable la incorporación de una etapa previa de pre-cultivo en puré de fresa estéril para garantizar su plena adaptación al medio a fermentar. De esta forma, se consigue acelerar la actividad de las bacterias, una vez se inoculan en el fermentador, y la producción de ácido glucónico, generando un entorno ácido y, en definitiva, hostil para el crecimiento de otros microorganismos indeseados. Por otro lado, la estimación de algunos parámetros fundamentales para el diseño de los biorreactores necesarios, como son, por ejemplo, la velocidad específica máxima de crecimiento y el rendimiento de células en base a sustrato, se revelan como problemas difíciles de resolver si se tiene en cuenta las características del medio de cultivo, con alto contenido de sólidos en suspensión y las dificultades, ya mencionadas, para el cultivo en placa de estas bacterias. En efecto, estos aspectos dificultan la obtención de datos fiables de la evolución de la concentración celular a lo largo del ciclo fermentativo, datos que son necesarios para la estimación de dichos parámetros. Por lo tanto, se ha propuesto un método alternativo que permite estimar la velocidad específica máxima de crecimiento del cultivo, e incluso, el rendimiento aparente de células en base a glucosa, a partir de sólo valores experimentales de concentración de glucosa. El método ha sido validado con datos experimentales obtenidos por otros investigadores para otros microorganismos con metabolismos similares. Por último, la capacidad de la bacteria para seguir transformando el ácido glucónico formado, dependiendo de las condiciones ambientales, ha hecho necesario evaluar la influencia de la concentración de sustrato, variable clave, sobre la estabilidad del producto obtenido. En este sentido, la posibilidad de disponer de sustratos de fresa con distinto grado de concentración y/o la posibilidad de enriquecimiento en azúcares empleando otros suplementos de origen natural, han facilitado el estudio de la influencia de la concentración inicial de glucosa sobre la estabilidad del ácido glucónico contenido en el producto final. Los resultados obtenidos muestran que, desde un punto de vista práctico, para obtener fermentados con la máxima concentración posible de ácido glucónico y diferentes niveles de fructosa, es necesario controlar el tiempo de fermentación. Así, en purés de fresa sin azúcares añadidos, en los que la concentración de glucosa es baja, el proceso ha de detenerse tan pronto como ésta se haya consumido, de otro modo, la bacteria comenzaría a transformar en cetoácidos el ácido glucónico formado. Por otro lado, en purés de fresa con azúcares añadidos, en los que la concentración de glucosa fue de hasta cuatro veces mayor que en el caso anterior, el ácido glucónico formado se conservaba sin problema. Sin embargo, si además se desea conservar la fructosa residual, es necesario considerar la actividad de las levaduras presentes en el medio, que tras un periodo de 25-30 h de fermentación abandonan el estado de latencia en el que quedaron tras el tratamiento industrial de pasteurización. 4. Bibliografía Información más detallada de todo el trabajo realizado se puede encontrar en la siguiente bibliografía: 1. Cañete-Rodríguez, A.M., Santos-Dueñas, I.M., Jiménez-Hornero, J.E., Ehrenreich, A., Liebl, W., García-García, I. (2016) Gluconic acid: Properties, production methods and applications - An excellent opportunity for agro-industrial by-products and waste bio-valorization, Process Biochemistry, doi: 10.1016/j.procbio.2016.08.028. 2. Cañete-Rodríguez, A.M., Santos-Dueñas, I.M., Torija-Martínez, M.J., Mas, A., Jiménez-Hornero, J.E., García-García, I. (2015) Preparation of a pure inoculum of acetic acid bacteria for the selective conversion of glucose in strawberry purée into gluconic acid. Food and Bioproducts Processing 96, pp. 35-42. 3. Cañete-Rodríguez, A.M., Santos-Dueñas, I.M., Jiménez-Hornero, J.E., Torija-Martínez, M.J., Mas, A., García-García, I. (2016) An approach for estimating the maximum specific growth rate of some bacteria in complex media without cell concentration data. An example: Gluconobacter japonicus growing in strawberry purée. Biochemical Engineering Journal 105, pp. 314-320. 4. Cañete-Rodríguez, A.M., Santos-Dueñas, I.M., Jiménez-Hornero, J.E., Torija-Martínez, M.J., Mas, A., García-García, I. (2016) Revalorization of strawberry surpluses by bio-transforming its glucose content into gluconic acid. Food and Bioproducts Processing 99, pp. 188-196.