Producción de compuestos bioactivos a partir de biomasa algal basada en la biofiltración y la biorrefinería

Resumen

La presente Tesis Doctoral estudia la acumulación y producción de compuestos bioactivos con interés biotecnológico en macroalgas cultivables o que potencialmente puedan ser cultivadas en condiciones de alto nitrógeno inorgánico (amonio; N-NH4+), simulando las condiciones de efluentes de piscifactorías. Además, las macroalgas fueron cultivadas bajo radiación solar o artificial (radiación activa fotosintética (PAR, 400-700nm), complementada con radiación ultravioleta (UVR, 280-400 nm), con el fin de valorar la fotoestimulación de compuestos bioactivos y la productividad de la biomasa en el contexto del concepto de la Biorrefinería. En el Capítulo 1, se realizó un estudio de ficoprospección, con la finalidad de seleccionar las especies cultivables o con potencialidad de ser cultivadas de manera intensiva en sistemas de Acuicultura Multitrófica Integrada (IMTA), para ser empleadas en la extracción de compuestos bioactivos con aplicaciones nutracosméticas o cosmecéuticas. Para ello, se recolectaron diferentes macroalgas en distintas zonas del Sur de España que presentan alta irradiancia solar (Gran Canaria, Málaga y Cádiz). Las especies seleccionadas fueron las macroalgas rojas Gelidium corneum (Hudson) J.V. Lamouroux, Gelidium pusillum (Stackhouse) Le Jolis, Porphyra umbilicalis Kützing, Halopithys incurva (Hudson) Batters, Gracilariopsis longissima (S.G.Gmelin) M.Steentoft, L.M.Irvine & W.F.Farnham e Hydropuntia cornea (J.Agardh) M.J.Wynne y la macroalga verde Ulva rotundata Bliding. Como control positivo de compuestos bioactivos, aunque no sea una especie cultivable, se empleó el liquen marino Lichina pygmaea. Se prepararon extractos algales con diferentes solventes acuosos e hidroalcohólicos que potencialmente pueden contener compuestos bioactivos de interés biotecnológico. Entre los solventes, el mayor rendimiento de extracción se observó en el solvente acuoso (H2O) y metanólico (MeOH 20%). La mayor actividad antioxidante, expresada en equivalentes de Trolox, se encontró en los extractos de las macroalgas rojas, H. cornea seguido de los extractos de G. longissima, H. incurva, P. umbilicalis y G. pusillum, mientras que la actividad más baja se detectó en los de la macroalga verde U. rotundata. La actividad antioxidante se correlacionó con la concentración de compuestos bioactivos, sin descartar la acción sinérgica entre los compuestos. Se propone preferentemente el uso del método ABTS con respecto al DPPH o BBM, ya que el ABTS valora la capacidad antioxidante tanto de compuestos hidro- como liposolubles. En el Capítulo 2, tres de las especies de algas rojas estudiadas en el Capítulo 1 con mayor capacidad antioxidante, H. cornea, G. longissima y H. incurva, fueron cultivadas durante 14 días en el laboratorio en agua de mar enriquecida con alto contenido de nutrientes (NH4+ y PO43-, 150 y 15 μM, respectivamente) y con dos niveles de radiación: PAR y PAB (PAR + UVB + UVA). Se estudiaron los efectos del tipo de radiación bajo alta disponibilidad de N-NH4+ sobre el crecimiento, pigmentos fotosintéticos (clorofila a, carotenoides y ficobiliproteínas), actividad fotosintética y composición bioquímica. La tasa de transporte electrónico máximo (ETRmax) aumentó a lo largo del tiempo y los valores fueron más altos en PAR que en PAB en H. incurva y en H. cornea, mientras que en G. longissima ocurrió lo contrario. La eficiencia fotosintética (αETR) disminuyó con el tiempo en las dos primeras especies, pero en G. longissima aumentó, mientras que la irradiancia de saturación (EkETR) y el amortiguamiento no fotoquímico máximo (NPQmax) aumentaron, lo que indica una aclimatación fotosintética como la de algas “tipo sol”. En las tres especies, el contenido en N interno y los pigmentos fotosintéticos aumentaron en PAB tras 14 días de cultivo. Se identificaron en todas las especies cinco MAAs mediante Cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) y Espectrometría de masas por ionización mediante electrospray (ESI-MS): Palythinol, Shinorine, Porphyra-334, Palythine y Asterina-330. El contenido total de MAAs y la actividad antioxidante aumentaron a lo largo del tiempo en las tres especies, siendo más alto en presencia de UVR. Por lo tanto, se concluye que las tres especies presentaron un mecanismo eficaz de fotoprotección basado en la acumulación de compuestos fotoprotectores con actividad antioxidante, así como en una alta disipación de la energía de excitación (mayor NPQmax). En el Capítulo 3 se discuten las implicaciones biotecnológicas de los cambios metabólicos relacionados con la disponibilidad de la radiación y los nutrientes en Gracilariopsis longissima en un experimento bifactorial en el laboratorio durante 14 días. Además de las variables fisiológicas y bioquímicas, en este estudio, se analizó la morfología y la ultraestructura a nivel celular mediante microscopía óptica (ML) y de transmisión (TEM). Se observaron tres alteraciones morfológicas principales relacionadas con mecanismos de defensa contra la UVR: un incremento en el espesor de la pared celular, una mayor acumulación de gránulos de almidón y una multiplicación del número de capas de células corticales. Por lo tanto, G. longissima mostró una alta aclimatación a UVR y a los nutrientes, sin mostrar disminución en la tasa fotosintética a la vez que aumentó la acumulación de compuestos nitrogenados con rol fotoprotector y con capacidad antioxidante (MAAs). Por otra parte, el almidón, los lípidos y los compuestos fenólicos aumentaron principalmente en presencia de UVR, pero a baja disponibilidad de nutrientes. En el Capítulo 4, se realizó un experimento a mayor escala en las instalaciones acuícolas del Banco Español de Algas (BEA) en el municipio de Telde (Gran Canaria) con Hydropuntia cornea en tanques de 90 L y a una densidad algal de 9 g PF L-1. Se estudiaron los efectos interactivos de la radiación y la disponibilidad de nutrientes con un diseño experimental bifactorial: PAR (cultivo dentro de un invernadero) versus PAB (cultivo fuera del invernadero) y emulando condiciones de efluentes de piscifactoría (altos niveles de NH4+ y PO43-) versus baja disponibilidad de nitrógeno (control). Se concluye que la especie H. cornea es una excelente candidata para el cultivo en condiciones de alto nitrógeno (aguas ricas en N-NH4+ hasta 150 µmol NH4+) en circuito abierto con una capacidad de biofiltración del 98% (NUE) y una tasa de incorporación de N de hasta 75 mmol NH4+ m-2 h-1. Además, H. cornea presentó una alta acumulación de compuestos bioactivos de interés tanto nitrogenados (aminoácidos tipo micosporina y proteínas), como carbonados: ácidos grasos poliinsaturados (Omega-3 y Omega-6) y compuestos fenólicos, variando la acumulación en función de las condiciones de cultivo. Por ejemplo, se consiguió una productividad de MAAs de 237 mg MAAs m-2 d-1 en el tratamiento con alto N-NH4+ en presencia de UVR (fuera del invernadero), siendo hasta el momento el mayor de los valores reportados en la bibliografía. El contenido de ácidos grasos monoinsaturados (MUFAs) y de ácidos grasos poliinsaturados (PUFAs), aumentaron un 77 y 93%, respectivamente en todos los tratamientos de promedio respecto a los contenidos iniciales, reduciéndose así el contenido en ácidos grasos saturados (AGS) en un 55%. Dentro del contenido en PUFAS al final del experimento (35 días), el 72.65% del total correspondió a ácidos grasos del grupo Omega-6, 25.52% del grupo Omega-9 y 1.82% del grupo Omega-3. Esto correspondió, respecto a los valores de la biomasa a los 7 días de cultivo, a una reducción del 87% en Omega-3 y un 19% en Omega-9. En ese tiempo (7 días), la proporción Omega-6/Omega-3 de la biomasa algal fue 3.2-3.4 en algas crecidas dentro del invernadero (sin UVR) mientras que fuera del invernadero (con UVR) fue 1.4-7.3. Los valores recomendados de la proporción Omega-6/Omega-3 en una dieta sana en grasas es de 1-2. Así pues, bajo ciertas condiciones de cultivo, la biomasa de H. cornea adquiere buenas características para su uso posterior como alimento funcional, aunque el contenido en lípidos totales no sea tan alto como el de microalgas. Por todo ello, se concluye que las estrategias fotobiológicas junto con la biofiltración de N-NH4+ (como simulación de efluentes de peces) y la acumulación selectiva de compuestos bioactivos, muestra que el cultivo de H. cornea en tanques, constituye un excelente sistema donde puede ser aplicado el concepto de biorrefinería en el contexto de la Economía azul, esto es, una aproximación a la biotecnología y la prestación de servicios ambientales debido a la depuración de aguas con alto nivel de N-NH4+. Por lo tanto, el cultivo masivo de esta especie supone un reto técnico y comercial para el desarrollo de una producción de biomasa rentable a lo largo del tiempo, dedicada a la producción de compuestos de alto valor añadido (nutracéuticos y cosmecéuticos) y otros productos como bioestimulantes para la agricultura o piensos para alimentación. Todo esto sumado, a los servicios ambientales que presta esta especie en la depuración de aguas. En el Capítulo 5 se estudió la citotoxicidad y la capacidad inmunológica de extractos acuosos concentrados por rotavaporación de dos de las algas que presentaron la mejor bioactividad en los extractos en esta Tesis Doctoral, H. cornea (Capítulos 1, 2 y 4) y G. longissima (Capítulos 1, 2 y 3). Este estudio fue diseñado para evaluar el uso potencial de los extractos en cosmecéutica y sobre la bioseguridad de los extractos. La citotoxicidad de los extractos fue evaluada mediante el ensayo MTT, el cual se basa en la reducción metabólica del bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol (MTT) realizada por la enzima mitocondrial succinato-deshidrogenasa en tres líneas celulares. Ambos extractos no mostraron actividad citotóxica en células humanas (HaCaT y HGF), aunque sí mostraron citotoxicidad en células murinas tumorales del sistema inmune (macrófagos RAW 264.7), por lo que su uso en productos cosméticos en relación con la salud y seguridad, queda en gran parte garantizado. Por otro lado, se estudió la actividad inmunológica en macrófagos murinos RAW 264.7 a una concentración menor de 100 µg mL-1 y más baja que el EC50, mediante la producción de compuestos pro-inflamatorios a través de un ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas como el factor de necrosis tumoral-α (TNF-α) o anti-inflamatorios/proinflamatorios como la interleucina-6 (IL-6). Los extractos de H. cornea y G. longissima indujeron de forma exponencial la biosíntesis de ambos, de manera que por primera vez estos resultados indican que los extractos de H. cornea y G. longissima inducen activamente la producción de citoquinas. Por último, en el Capítulo 6, se diseñó un producto cosmético con actividad antioxidante y capacidad fotoprotectora empleando extractos acuosos de H. cornea a partir de la biomasa producida en el Banco Español de algas (Capítulo 4) y otros ingredientes usados en cosmética. Es sabido que la exposición excesiva a la UVR puede producir efectos negativos en gran parte mediados por las especies reactivas de oxígeno (ROS) generadas en las vías oxidativas. Una de las formas de reducir el riesgo de la UVR en humanos es el uso de cremas fotoprotectoras con capacidad antioxidante. En capítulos previos (Capítulos 1, 2 y 4), se mostró la alta capacidad antioxidante de los extractos de H. cornea. Y en este capítulo se determinó la capacidad fotoprotectora mediante el método Colipa (2011) empleando un simulador solar para cuantificar los siguientes parámetros fotoprotectores: Factor de Protección Solar relacionado con el eritema (FPS) que se trata de una respuesta mediada principalmente por radiación UVB; Factor de Protección de UVA, relacionado con el bronceado persistente expresado como UVAFPS; y el Factor de Protección frente a efectos biológicos sobre piel, ojos y efectos moleculares en los intervalos espectrales de UVB (FAPEBUVB) y UVA (FAPEBUVA). Se emplearon diferentes combinaciones de filtros físicos o inorgánicos (TiO2 y ZnO), filtros químicos u orgánicos (Tinosorb M y S) y filtros biológicos como extractos de Hydropuntia cornea o de Ginko biloba, aceite de Pongamia pinnata (Karanja) y Vitamina C y E. El extracto concentrado de H. cornea mostró un efecto sinérgico con el extracto de G. biloba y con el aceite de Karanja rindiendo un FPS de 15, una longitud de onda crítica de 386 nm y un UVAFPS de 4.3; lo que se corresponde al de un fotoprotector ideal (valores mínimos recomendados) frente a UVR. En este capítulo, se discute cómo la aplicación de extractos algales en combinación con otros ingredientes naturales, puede ayudar al diseño de una nueva generación de fotoprotectores contra los efectos negativos de la UVR, además de las enormes ventajas relacionadas con su alta fotoestabilidad y termoestabilidad y por no presentar toxicidad ni para la salud humana ni para el medio ambiente al tratarse de un producto fabricado con componentes naturales y por lo tanto biodegradables.