El adaptador de membrana lat como regulador de la transmisión de señales intracelulares asociadas a tcrfunción de diversas secuencias consenso no basadas en tirosina

Resumen

La función protectora de las células T depende de su capacidad para reconocer células que han internalizado agentes patógenos o sus productos . Las células T llevan a cabo dicha función reconociendo fragmentos peptídicos de proteínas derivadas de agentes patógenos, presentados a través de las moléculas de histocompatibilidad (MHC) de tipo I o bien de tipo II. Para que tenga lugar el reconocimiento, el linfócito T tiene un receptor específico de membrana, el TCR, unas cadenas ?, las moléculas de CD3 ?, ?, ? y las cadenas polipeptídicas ?, que desencadenan la transducción de señales intracelulares. El reconocimiento del antígeno presentado en la MHC por parte del TCR, desencadena la activación de Lck que fosforila resíduos de tirosina de los ITAM (motivos de activación del inmunoreceptor basados en tirosina) que se encuentran en la parte citosólica de las moléculas CD3 y de las cadenas ? (J. Lin and A. Weiss, J Cell Sci 114 (2001), pp. 243-244.). La fosforilación de estos motivos recluta hacia el complejo de membrana TCR/CD3 a la tirosín kinasa ZAP-70. A su vez la kinasa ZAP-70 es activada por Lck, se desencadena de este modo una serie de fosforilaciones por parte de ambas kinasas que en último término conducen a la activación de diferentes rutas de señalización. La proteína adaptadora LAT (Linker for the activation of T cells) se identificó como una proteína transmembrana de 36 a 38 kDa, y como uno de los sustratos más importantes de ZAP-70 (W. Zhang, J. Sloan-Lancaster, J. Kitchen, R.P. Trible and L.E. Samelson, Cell 92 (1998), pp. 83-92). Del mismo modo que muchos adaptadores de membrana, LAT presenta en su secuencia aminoacídica nueve residuos de tirosina conservados que tras ser fosforilados se convierten en potenciales sitios de unión de diferentes proteínas. De hecho la fosforilación de LAT por parte de ZAP-70 inicia el reclutamiento y la unión de Grb2, Grap, Gads-SLP-76, PLC-?, Vav, Cbl y la subunidad reguladora de PI-3K (W. Zhang, J. Sloan-Lancaster, J. Kitchen, R.P. Trible and L.E. Samelson, Cell 92 (1998), pp. 83-92). Una vez que se unen a LAT, estas proteínas pueden ser activadas y desencadenar la activación de distintas rutas de señalización. De cualquier modo se conoce muy poco a cerca de otros motivos conservados en la secuencia aminoacídica de LAT. El presente trabajo se basa en el estudio de diferentes motivos basados en serina, prolina y potenciales dianas de caspasas, conservados en la secuencia aminoacídica de LAT y en la mutación de dichos motivos para estudiar el efecto en diferentes rutas de señalización relacionadas con procesos de activación, desarrollo y proliferación linfocitaria. Para el presente trabajo se ha utilizado la línea JCaM2.5 como modelo de estudio del efecto de las mutaciones realizadas sobre la secuencia silvestre de LAT. Tras la realización de las mutagénesis pertinentes sobre el cDNA silvestre de LAT, se desarrollaron transfectantes estables para estudiar entre otras, la activación de diferentes eventos como la activación de diferentes rutas de las MAPK kinasas, producción de citokinas, generación de flujos de calcio citosólicos, y estudio de apoptosis celular. Para ello se han puesto en práctica diferentes técnicas de micorbiología para el clonaje de LAT y la obtención de los plásmidos para la generación de los transfectantes estables y transitorios, y técnicas de biología molecular como western blot, diferentes técnicas de citometría de flujo y fluorímetro.