Interacción entre la función reproductiva y metabólicacaracterización del papel de factores neuroendocrinos y el sensor energético, proteina quinasa activada por amp (ampk)

Resumen

1. INTRODUCCIÓN La reproducción es un proceso costoso en términos de consumo energético que, si bien es esencial para la supervivencia de las especies, es prescindible a nivel individual. Por lo tanto, la maduración y la función del eje reproductor están estrechamente conectadas con el estado energético del organismo y se encuentran bajo el control de una red sofisticada de factores reguladores, donde señales neuronales, hormonales y ambientales cooperan para garantizar su correcta maduración, durante distintas etapas del desarrollo, y su mantenimiento funcional en la edad adulta, siempre que las condiciones nutricionales y metabólicas sean adecuadas. El éxito de este proceso está dirigido por la acción integrada de las señales del denominado eje Hipotálamo-Hipófiso-Gonadal (HHG), en el que las neuronas GnRH ocupan una posición destacada controlando la reproducción y su modulación mediante señales metabólicas (1, 2). Las neuronas Kiss1, por su parte, son elementos clave en el control de la reproducción, ya que regulan la liberación de GnRH y, por ende, de las gonadotropinas, y además son capaces de transmitir información metabólica a las neuronas GnRH, estimulando o inhibiendo su síntesis (3). En este contexto, en las últimas décadas se han descubierto un gran número de señales de origen central y periférico, responsables de la adecuación de la función reproductora a la disponibilidad de recursos energéticos del organismo. En líneas generales, puede asumirse que las señales de suficiencia energética (anorexigénicas) estimulan la puesta en marcha y funcionamiento del eje reproductor, mientras que las señales que informan de la escasez de recursos energéticos (orexigénicas) inhiben el funcionamiento del eje reproductor. De esta forma, se han desarrollado mecanismos sofisticados durante la evolución para permitir una inhibición específica del eje reproductor en condiciones energéticas desfavorables (3). Dichas condiciones metabólicas adversas pueden concurrir en situaciones tanto de déficit como de exceso de los depósitos energéticos del organismo. Así, tanto en países desarrollados como en países en vías de desarrollo, la prevalencia de la obesidad y las patologías asociadas está aumentando a un ritmo de proporciones epidémicas. Las razones se deben a una combinación entre la predisposición genética y los factores sociales y ambientales, que conducen a un desequilibrio en el balance energético, y se asocia con la hipertensión, la diabetes tipo 2, el hígado graso y una variedad de trastornos conocidos como síndrome metabólico. De otra parte, diversas condiciones, algunas de prevalencia creciente, se asocian a un déficit energético severo, tales como la anorexia nerviosa, la caquexia tumoral y otras patologías consuntivas, o incluso programas de entrenamiento físico intensivo, tales como los propios de deportistas profesionales. En unas y otras condiciones, dependiendo del momento en el que concurran, tanto la pubertad como la fertilidad y la función gonadal pueden verse severamente afectadas (4). A su vez, la propia función gonadal puede influenciar el estado metabólico del organismo, de suerte que las secreciones gonadales, como los andrógenos y los estrógenos, son potentes moduladores de la homeostasis metabólica y del peso corporal. Por todo ello, diversas evidencias experimentales apuntan que no sólo cambios nutricionales y otras situaciones de estrés metabólico, sino también niveles inapropiados de hormonas sexuales en determinados periodos del desarrollo, pueden contribuir a desencadenar alteraciones metabólicas y a modificar de manera permanente la función reproductora (5, 6). Sin embargo, los mecanismos neurohormonales que subyacen a esta interacción bidireccional entre el metabolismo y el eje reproductor permanecen aún en gran medida desconocidos. Por otro lado, además de distintas señales centrales y periféricas, evidencias recientes sugieren la participación de sensores energéticos celulares en el control metabólico de la función reproductora. Entre ellos, destaca la proteína quinasa activada por AMP, denominada AMPK, un sensor energético clave que se activa en condiciones de déficit energético y está implicado en la homeostasis energética del organismo, principalmente a través de la regulación de la ingesta y el gasto energético, ejerciendo su acción en los núcleos hipotalámicos, arcuato (ARC) y ventromedial (VMN), respectivamente (7). Además, estudios recientes han sugerido que AMPK opera como una vía clave que informa y modula al eje HHG en situaciones de insuficiencia energética, si bien las evidencias que apoyan dicho papel son aun fragmentarias y no concluyentes, sin una caracterización clara del papel de la señalización de AMPK en poblaciones neuronales clave para el control metabólico de la función reproductora (1). En suma, aun cuando es evidente que existe un claro acoplamiento entre el estado energético y metabólico del organismo, y la maduración y función del eje reproductor, aún no se conocen en profundidad las redes neuronales y las bases hormonales y moleculares de los mecanismos que intervienen en este fenómeno fisiológico. Todo ello hace necesario un mejor conocimiento de las complejas interacciones bidireccionales entre el estado metabólico y la función reproductiva, las bases neuroendocrinas de dichas interacciones, y los mecanismos moleculares que conectan ambos sistemas corporales relevantes. Teniendo en cuenta lo expuesto previamente, el objetivo general de esta Tesis Doctoral ha sido profundizar en la caracterización de las interacciones dinámicas entre el estado metabólico del organismo y aspectos clave de la maduración y la función reproductora. En este contexto, en esta Tesis se ha prestado especial atención a la definición del impacto de cambios en la función gonadal y la exposición a factores obesogénicos sobre el perfil endocrino-metabólico en la edad adulta y a la evaluación del posible papel del sensor energético celular, AMPK, actuando en las neuronas GnRH y Kiss1, en el control metabólico de la función reproductora. 2. CONTENIDO DE LA INVESTIGACIÓN Esta Tesis Doctoral se ha dividido en dos bloques experimentales principales. En el bloque experimental 1, se evaluó, en ratas macho y hembra, en la edad adulta temprana (PND50) y en periodo adulto (PND150), el impacto de la manipulación nutricional postnatal y del ambiente esteroideo neonatal sobre la función metabólica y gonadotrópica. Nuestros resultados muestran, en primer lugar, que la sobrenutrición aplicada desde el periodo neonatal, consistente en una sobrealimentación durante la lactancia (SL) seguida de una dieta alta en grasa tras el destete (HFD), indujo alteraciones detectables en diversos parámetros metabólicos y gonadotrópicos en ratas de ambos sexos, aunque estos efectos fueron mucho más evidentes en los machos que en las hembras. Así, las ratas macho SL/HFD, sobrenutridas desde el periodo neonatal, mostraron no solo una marcada ganancia de peso corporal frente a los controles normonutridos (NL/CD), sino que presentaron indicadores evidentes de hipogonadismo central y desregulación de la homeostasis glucídica. Destacablemente, la obesidad indujo en machos una supresión de los niveles séricos de gonadotropinas, detectables a los 50 y 150 días de edad, que condujo a una disminución significativa de los principales andrógenos testiculares, testosterona, DHT y androstendiona, sin alteraciones detectables en los niveles de progesterona, en el día postnatal 150 (PND150). En cuanto a la homeostasis metabólica, los machos obesos mostraron, en el PND150, niveles claramente elevados de glucemia basal, así como perfiles alterados en los test de tolerancia a la sobrecarga de glucosa (GTT) e insulina (ITT). Por el contrario, la sensibilidad al impacto metabólico y gonadotrópico de estas manipulaciones obesogénicas fue sustancialmente menor en las ratas hembra. Así, y a pesar de la marcada ganancia ponderal frente a ratas hembra normonutridas (NL/CD), las hembras adultas obesas no presentaron cambios significativos en los niveles de LH y FSH circulantes, ni mostraron una supresión en las concentraciones séricas de andrógenos gonadales, aunque sí presentaron un incremento en los niveles de androstendiona y estradiol, sin cambios significativos en los niveles de progesterona y estrona. En cuanto a los parámetros metabólicos, las hembras obesas solo presentaron una disminución transitoria de las concentraciones séricas de insulina, selectivamente en el PND50, y una alteración muy puntual y moderada (circunscrita al minuto 20 del GTT) de la tolerancia a un bolo de glucosa en el PND150, sin modificaciones detectables ni en la glucemia basal ni en los valores de glucemia global durante el GTT o ITT. Adicionalmente, a fin de analizar las causas de este claro dimorfismo sexual, analizamos el impacto de la manipulación del ambiente esteroideo neonatal sobre las respuestas metabólicas y gonadotrópicas a las manipulaciones obesogénicas indicadas (sobrenutrición persistente: SL/HFD). En concreto, estudiamos el efecto de la androgenización neonatal en la rata hembra, que es sabido causa una masculinización de la diferenciación sexual del cerebro, que se asocia a disfunción ovárica y anovulación. Nuestros resultados evidencian que la androgenización neonatal resulta en una clara masculinización de los perfiles de respuesta a las manipulaciones obesogénicas, de tal forma que las ratas hembra androgenizadas presentaron un conjunto de alteraciones endocrino-metabólicas globalmente similares a las mostradas por los machos, pero no por las hembras no-androgenizadas sometidas a manipulaciones obesogénicas análogas. De esta forma, las ratas androgenizadas mostraron una mayor ganancia ponderal, así como alteraciones en los niveles basales de glucemia y en los perfiles de glucemia en el GTT y el ITT, que fueron análogas a las de machos obesos. Igualmente, de manera análoga a lo observado en machos obesos, las hembras androgenizadas sometidas a sobrenutrición durante la lactancia seguida de HFD mostraron una supresión de los niveles de LH y de FSH (esta última, solo en el PND50), que no se detectó en las hembras obesas control. Llamativamente, las hembras androgenizadas presentaron alteraciones tempranas (en PND50) en parámetros, tales como la supresión de LH o los perfiles de glucemia en GTT e ITT, que fueron superiores a las detectadas en machos obesos de la misma edad, lo que podría evidenciar un impacto más marcado de la combinación de manipulaciones obesogénicas y la androgenización neonatal sobre dichos indicadores de función gonadotrópica y metabólica. En todo caso, las hembras androgenizadas no presentaron una supresión análoga a la de los machos obesos en la secreción de andrógenos gonadales, posiblemente debido a las diferencias intrínsecas entre la esteroidogénesis testicular y ovárica. Finalmente, en este bloque experimental, analizamos igualmente el impacto, sobre la función gonadotrópica y metabólica en ratas adultas (PND150) de ambos sexos, de la eliminación completa de esteroides sexuales mediante gonadectomía (GNX), combinada o no con sobrealimentación postnatal y dieta rica en grasas. La eliminación de los ovarios mediante ovariectomía (OVX) en la edad adulta (PND90) causó un cierto incremento del impacto de las manipulaciones obesogénicas en ratas hembra en ciertos parámetros endocrino-metabólicos. Sin embargo, la magnitud de dichos cambios fue en general muy modesto, salvo en lo que respecta a la ganancia ponderal y los niveles de leptina, que se vieron muy marcadamente aumentados por la combinación de OVX con la sobrenutrición persistente (SL/HFD). En todo caso, y a diferencia de las hembras intactas, las hembras OVX obesas mostraron unos niveles de LH parcialmente suprimidos (respecto a las hembras OVX no obesas), y una tendencia a la elevación de los niveles basales de glucemia, junto a una moderada elevación en la resistencia a las acciones de la insulina, sin que se observaran cambios en los perfiles del GTT entre ratas obesas intactas y OVX. Finalmente, la orquidectomía (ORX) de las ratas macho en la edad adulta, como maniobra para la eliminación completa de las secreciones testiculares, no indujo en líneas generales un agravamiento evidente de los perfiles metabólicos, ni en los animales normonutridos ni en los obesos, salvo por una elevación en los niveles basales de insulina en machos ORX obesos, que sin embargo no se asoció a alteraciones evidentes en los perfiles de GTT e ITT. En todo caso, es destacable que en los machos normonutridos, la ORX resultó en una disminución del peso corporal, mientras que la ORX no agravó el cuadro de obesidad causado por la sobrenutrición sostenida (SL/HFD) desde la lactancia. En el bloque experimental 2, empleamos modelos murinos genéticamente modificados, generados en nuestro laboratorio, denominados GAMKO y KAMKO, deficientes en la subunidad α1 de AMPK específicamente en las células GnRH y Kiss1, respectivamente, para caracterizar el papel de sensor metabólico, AMPK, actuando selectivamente en estas poblaciones neuronales, en el control metabólico de la pubertad y la función gonadotrópica adulta. En condiciones de normonutrición, los ratones GAMKO hembra presentaron un adelanto de la edad de apertura vaginal, como signo externo de inicio de la pubertad, que se tradujo en una edad media de inicio puberal significativamente menor que en los ratones control. Este fenómeno no se detectó en ratones GAMKO machos, ni en ratones KAMKO de ambos sexos. En la misma línea, los ratones GAMKO hembra peripuberales presentaron un aumento de las respuestas secretoras de LH (como marcador subrogado de secreción de GnRH) a la administración de kisspeptina. A pesar de la ausencia de cambios fenotípicos de marcadores puberales en condiciones de normonutrición, los ratones hembra KAMKO presentaron una resistencia parcial al impacto deletéreo, en términos de retraso de inicio de la pubertad, de condiciones de balance energético negativo, en las que la actividad hipotalámica aumenta sustancialmente en condiciones fisiológicas. Así, mientras que en ratones hembra control, la subnutrición crónica tras el destete causó una disminución significativa del peso corporal, un retraso en la edad de apertura vaginal y una disminución del peso de ovario, la eliminación de la señalización de AMPK en células Kiss1, si bien no previno la caída del peso corporal causada por la subnutrición, de magnitud similar a la observada en ratones control subnutridos, sí evitó el retraso global en la edad de apertura vaginal inducido por dicha subnutrición, provocando además una marcada tendencia a la elevación de los niveles de LH y el peso de ovario en ratonas KAMKO subnutridas vs. controles sometidos a un protocolo similar de subnutrición. En la edad adulta, los perfiles de secreción pulsátil de LH no mostraron cambios detectables en ratones macho y hembra GAMKO, ni en hembras KAMKO. A pesar de la ausencia de alteraciones en los perfiles secretores de LH, selectivamente las hembras GAMKO mostraron un incremento de las respuestas secretoras de GnRH (evidenciada por las respuestas de LH) ante la aplicación de diversos estímulos del eje gonadotrópico, que incluyen la kisspeptina-10, el agonista de NKB (Senktide) y GnRH. De manera adicional, aplicamos distintos protocolos de déficit energético en ratones hembra GAMKO y KAMKO, a fin de evaluar si la ausencia de señalización de AMPK en neuronas GnRH o Kiss1 modifica las respuestas del eje gonadotrópico ante estas situaciones de estrés metabólico en la edad adulta. Nuestros estudios muestran que las ratonas GAMKO presentan un periodo de recuperación de la ciclicidad estral, como marcador de función ovárica, menor que el de ratones control tras la aplicación de dos protocolos diferentes de realimentación tras un periodo de subnutrición. De la misma forma, la supresión de diversos parámetros de secreción de LH (niveles medios, totales y basales) causada por el ayuno de 18 horas en ratones hembra control no se produjo en ratonas GAMKO sometidas a un protocolo similar de ayuno. En la misma línea, en hembras GAMKO sometidas a ayuno, las respuestas secretoras a kisspeptina fueron significativa-mente superiores a las que se detectaron en ratones control. Estos patrones de respuestas alteradas, observados en los ratones GAMKO ante la aplicación de protocolos de subnutrición o ayuno, contrastan con los detectados en las ratonas KAMKO, cuyos periodos de recuperación de la ciclicidad estral tras la realimentación en ratones subnutridos fueron similares que en los controles. De la misma forma, la supresión de los distintos parámetros de secreción pulsátil de LH que se observó tras el ayuno de 18 horas fue similar entre los genotipos control y KAMKO, con una disminución análoga de los niveles de LH media, total y basal tras el ayuno. Este conjunto de observaciones parecen evidenciar un papel más predominante de AMPK en neuronas GnRH en el control metabólico del eje gonadotrópico en la edad adulta, mientras que la función de AMPK en neuronas Kiss1 en el periodo adulto parece mucho más moderada.   3. CONCLUSIONES Las principales conclusiones de nuestro trabajo son: 1. Las alteraciones metabólicas y gonadotrópicas inducidas por la sobrenutrición mantenida desde la lactancia hasta la edad adulta presentan un marcado dimorfismo sexual, con una afectación mucho más notable en ratas macho que en hembras. Esta mayor sensibilidad de los machos a las manipulaciones obesogénicas se traduce no solo en una desregulación de la homeostasis glucídica en la edad adulta, sino también en la aparición de un cuadro de hipogonadismo hipogonadotropo asociado a obesidad, definido por una supresión incipiente de la secreción de gonadotropinas, detectable ya en la edad adulta temprana, que antecede a una profunda supresión de la secreción de andrógenos testiculares, que se asocia a hiperleptinemia, intolerancia a la sobrecarga de glucosa y resistencia a la insulina. 2. El estado de resiliencia de la rata hembra al impacto de manipulaciones obesogénicas sobre parámetros metabólicos y de función gonadotrópica se debe en gran medida a un correcto proceso de diferenciación sexual en etapas tempranas del desarrollo y la propia función ovárica, de suerte que la masculinización de los procesos de diferenciación sexual temprana, mediante androgenización neonatal, y, en menor medida, la eliminación de la función ovárica en la edad adulta, sensibilizan los sistemas metabólico y gonadotrópico a las acciones deletéreas de la sobrenutrición mantenida desde la lactancia hasta la edad adulta. 3. Específicamente en las hembras, el sensor energético celular, AMPK, actuando en neuronas GnRH, juega un papel relevante en el control metabólico de la pubertad y de la función gonadotrópica en la edad adulta, operando como una señal inhibitoria de la actividad neuronal GnRH, con un papel detectable tanto en condiciones de normonutrición como, especialmente, de balance energético negativo, en una acción dependiente de las secreciones ováricas. 4. En hembras, la señalización de AMPK en neuronas Kiss1 participa en el control metabólico de la pubertad, pero no parece intervenir de manera reseñable en la modulación de la función gonadotrópica en la edad adulta. En términos de regulación puberal, la actividad AMPK en neuronas Kiss1 contribuye a mediar el efecto inhibitorio de condiciones de subnutrición sobre la activación puberal del eje reproductor. 5. Junto con evidencias procedentes de estudios de expresión y farmacológicos previos, nuestros resultados en los modelos murinos, GAMKO y KAMKO, con ablación selectiva de la subunidad α1 de AMPK en células GnRH y Kiss1, respectivamente, han contribuido a caracterizar la naturaleza y relevancia fisiológica de la señalización hipotalámica AMPK en el control metabólico del eje reproductor, con un papel variable dependiendo del tipo neuronal en el que opere, el sexo, el momento del desarrollo y el estado nutricional. 4. BIBLIOGRAFÍA 1. M. S. Avendaño, M. J. Vazquez, M. Tena-Sempere, Disentangling puberty: novel neuroendocrine pathways and mechanisms for the control of mammalian puberty. Hum Reprod Update 23, 737-763 (2017). 2. J. Roa, M. Tena-Sempere, Connecting metabolism and reproduction: roles of central energy sensors and key molecular mediators. Mol Cell Endocrinol 397, 4-14 (2014). 3. M. Manfredi-Lozano, J. Roa, M. 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