Optimización de la producción aerobia de ácido succínico y ácido málico a partir de glicerol utilizando cepas de e. Coli modificadas genéticamente

  1. Soto Varela, Zamira Elena
Dirigida por:
  1. Jorge Bolívar Pérez Director
  2. Gema Cabrera Revuelta Directora

Universidad de defensa: Universidad de Cádiz

Fecha de defensa: 16 de noviembre de 2020

Tribunal:
  1. Inés Garbayo Nores Presidente/a
  2. Antonio Valle Gallardo Secretario
  3. Raúl Poutou Piñales Vocal
Departamento:
  1. Biomedicina, Biotecnología y Salud Pública

Tipo: Tesis

Teseo: 640773 DIALNET lock_openTESEO editor

Resumen

Los ácidos dicarboxílicos C4 como el ácido succínico y el ácido málico son productos con alto potencial industrial al ser precursores de diferentes químicos de interés en la industria farmacéutica, alimentaria y agrícola. Estos compuestos pueden ser producidos a través de procesos de fermentación microbiana por bacterias como Actinobacillus succinogenes, Mannheimia succiniciproducens y Anaerobiospirillum succiniciproducens para el caso del ácido succínico y por hongos como Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Penicillium oxalicum y la levadura Zygosaccharomyces rouxii para el caso del ácido málico. Sin embargo, con el advenimiento de las tecnologías del ADN recombinante y a través de la ingeniería metabólica es posible direccionar la producción de este metabolito modificando genéticamente la bacteria Escherichia coli, ya que, a diferencia de los productores naturales, esta bacteria es muy versátil metabólicamente, posee bajos requerimientos nutricionales y es de rápido crecimiento. Por otro lado, se ha estudiado el uso de diferentes sustratos para la producción de ácido succínico y ácido málico; no obstante, en miras de aprovechar los residuos industriales y con el propósito de promover una producción sostenible, se está utilizando el glicerol, un subproducto de la industria del biodiesel del cual hay una alta oferta. Este compuesto posee un alto grado de reducción de los átomos de carbono lo que permite la producción de productos químicos reducidos con mayores rendimientos que con el uso de carbohidratos. Sin embargo, a pesar de los altos rendimientos de ácido succínico y ácido málico obtenidos en condiciones anaerobias, el proceso se dificulta y retarda debido a inconvenientes en el mantenimiento del equilibrio de óxido-reducción, así como también por el bajo crecimiento en estas condiciones y la baja velocidad de consumo del sustrato. Por ello, se están desarrollando diversas estrategias para mejorar la producción en condiciones de aerobiosis haciendo uso de la ingeniería metabólica, lo cual ha permitido modificar el metabolismo del E. coli a través de la sobreexpresión y/o mutación de genes y así direccionarlo hacia la síntesis de estos compuestos; sin embargo, aún los rendimientos continúan siendo bajos. El objetivo del presente trabajo fue optimizar la producción de ácido succínico y ácido málico a partir de glicerol en condiciones de aerobiosis utilizando una cepa de E. coli modificada genéticamente. Para ello, en primera medida, se analizaron las rutas metabólicas implicadas en el metabolismo de estos compuestos utilizando la base de datos EcoCyc lo que permitió identificar fugas de carbono, definir estrategias de ingeniería metabólica e identificar las enzimas clave implicadas en estas estrategias, estas últimas fueron caracterizadas con el propósito de obtener información que pueda ser relevante para la optimización de la producción de estos compuestos. Posteriormente, se realizó la modificación genética de E. coli, construyéndose un mutante base con la mutación del gen de la subunidad A de la enzima succinato deshidrogenasa (sdhA), con el propósito de linealizar el ciclo de los ácidos tricarboxilicos (TCA) y con las mutaciones de los genes de las enzimas de las vías de síntesis de ácido acético como la acetato quinasa y la fosfato acetiltransferasa (ack-pta) y la piruvato oxidasa (pox) para evitar pérdidas de carbono. A partir de este mutante se desarrollaron dos estrategias en paralelo que fueron la mutación del gen del represor de la vía del glioxilato (iclR) y la mutación del gen de la enzima 6 fosfogluconato deshidrogenasa (gnd) que participa en la rama oxidativa de la vía de las pentosas fosfato, ya que trabajos anteriores han demostrado que por sí sola esta mutación aumenta las cantidades de ácido succínico, pero en condiciones de anaerobiosis. Es así como se construyeron tres mutantes: M4: (ΔsdhAΔack-ptaΔpox), M4-ΔiclR (ΔsdhAΔack-ptaΔpoxΔiclR) y M4-Δgnd (ΔsdhAΔack-ptaΔpoxΔgnd) los cuales fueron analizados con dos herramientas de metabolómica: la espectroscopia de análisis de infrarrojo con transformada de Fourier (FT-IR) y cromatografía de gases acoplada a masas (GC-MS). Adicionalmente, se analizó la sobrexpresión de las enzimas anapleróticas y la malato deshidrogenasa bajo el promotor inducible pBAD, utilizando inicialmente una baja inducción (L-arabinosa 0,0002 %), como ensayo preliminar y posteriormente, una alta concentración (L-arabinosa 0,02 %) y a partir de este screening se seleccionaron dos cepas, una productora de ácido málico y la otra productora de ácido succínico. En cada una de estas cepas se realizó un diseño experimental Plackett-Burman para determinar qué componentes del medio M9 afectan a la producción de ambos metabolitos. Posteriormente, se procedió a estudiar el efecto de los factores más influyentes en ambos mutantes a partir del cual se optimizó el medio M9 para la producción de ácido málico, pero a raíz de que, con la evaluación de estos factores, las cantidades de ácido succínico aun no mejoraron, se realizó un diseño experimental para la optimización del medio de cultivo M9 para la mejorara de la producción de este compuesto. El medio optimizado fue entonces evaluado en cepas con la mutación de genes relacionados con la síntesis de ácidos grasos y el mutante M4-Δgnd con la sobrexpresión de la Ppc. Los resultados obtenidos en el presente trabajo mostraron inicialmente que las vías asociadas directamente a la producción de ácido málico y ácido succínico fueron el TCA, la glicolisis y la vía del glioxilato; siendo los metabolitos más importantes: el piruvato, el acetil-CoA, la D-glucopiranosa 6-fosfato y el D-gliceraldehido 3-fosfato, por ser puntos de fuga de carbono a través de vías alternas como la vía de síntesis de ácido acético, la vía de síntesis de ácidos grasos y la vía de las pentosas fosfato. Se seleccionaron y caracterizaron inicialmente 57 enzimas dentro de estas rutas incluyendo además las de la asimilación del glicerol y a partir de estas, se eligieron 14 enzimas asociadas a las estrategias para la mejora de la síntesis de ambos compuestos, cuya característica más importante reside en un amplio rango de pH. La linealización del TCA con la mutación del gen sdhA mostró una acumulación de ácido succínico, mayor que con la mutación del operón completo sdhCDAB y las subsiguientes mutaciones de las vías de síntesis ácido acético permitió la reducción de la producción de ácido acético con el consecuente aumento de la producción de ácido succínico en alrededor de un 80 %. Las mutaciones de los genes del represor transcripcional de unión al ADN de la vía del glioxilato (iclR) y gnd favorecieron el aumento de la producción de ácido succínico en el mutante M4, el análisis metabolómico mostró una disminución de la mayoría de los metabolitos de la glicolisis con estas dos mutaciones y, asimismo, se evidencia con la mutación de iclR una acumulación de los metabolitos manitol, trehalosa y Fructosa 1,6-bifosfato (FBF) y con la mutación de gnd una regulación negativa del metabolismo del nitrógeno. A continuación, se realizó sobre este mutante un screening de sobreexpresión con las enzimas anapleróticas fosfoenolpiruvato carboxilasa (Ppc), fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (Pck) y las enzimas málicas (MaeA y MaeB), además de la malato deshidrogenasa (Mdh). Con el ensayo preliminar a baja concentración de L-arabinosa, solo se observó un ligero aumento en la producción de ácido succínico y de ácido málico al sobreexpresar la Mdh. Sin embargo, cuando se utilizó una alta concentración de inductor, la sobreexpresión de la Ppc dio lugar a un aumento considerable de ácido succínico en la cepa M4, mientras que la sobreexpresión de la Pck provocó un considerable aumento en la producción de ácido málico tanto en el mutante M4 como en el M4-ΔiclR, siendo un poco mayor en el caso de esta última cepa. Del estudio mediante diseño experimental Plackett-Burman, se concluyó que el principal factor que afecta a la producción de ambos compuestos fue la concentración del inductor de la expresión (L-arabinosa) y, adicionalmente, para el caso del mutante M4-ΔiclR/pBAD-pck fueron influyentes la concentración de carbonato de sodio, bajo la forma en el medio de cultivo de hidrogeno carbonato de sodio y la de glicerol; mientras que para el mutante M4/pBAD-ppc fueron además del glicerol, la concentración de NH4Cl, MgSO4 y la cantidad de los elementos traza. Pruebas adicionales determinaron que para la producción de ácido málico en el mutante M4-ΔiclR/pBAD-pck la concentración de carbonato ideal fue de 4 g/L, lo que permitió un consumo completo de una concentración inicial de 10 g/L de glicerol. Sin embargo, en ambos mutantes a partir de 10 g/L de glicerol este no alcanza a consumirse. Por ello, el análisis de ajuste a modelos de crecimiento microbiano mostró en estos mutantes un mejor ajuste al modelo logístico que al modelo de Monod. Por otro lado, el NH4Cl fue limitante en concentraciones de hasta 0,5 g/L y fue inhibitorio a una concentración de 3,5 g/L en el mutante M4-ΔiclR/pBAD-pck. El medio optimizado fue con una concentración de 0,87 g/L de NH4Cl, 2 mL de MgSO4 1 M y 61 µL (2,3 g/L FeCl3·6H2O, 0,039 g/L CuSO4·5H2O, 0,049 g/L ZnSO4·7H2O, 0,32 g/L MnCl2-7H2O, 0,129 g/L CoCl2·6H2O, 0,037 g/L (NH3)6Mo7O24·4H2O and 0,25 g/L H3BO3) de elementos trazas. El uso de este medio con los mutantes de la síntesis de ácidos grasos permitió un ligero aumento del rendimiento del ácido succínico con la mutación del gen FabF y un aumento de la producción de ácido málico con la mutación del gen FadR. En resumen, la producción volumétrica de ácido málico alcanzada con las condiciones optimizadas de 4 g/L de carbonato y 10 g/L de glicerol fue de 5,1 g/L con el mutante M4-ΔiclR/pBAD-pck y, por su parte, con el medio optimizado para la producción de ácido succínico se obtuvieron 3,51 y 4,40 g/L de ácido succínico con los mutantes M4/pBAD-ppc y M4-Δgnd/pBAD-ppc, respectivamente. Estos hallazgos reflejan que el direccionamiento del metabolismo de la bacteria E. coli mediante herramientas de ingeniería genética, sumado a la optimización de las condiciones de cultivo permitieron el mejoramiento de la producción volumétrica de ambos metabolitos a partir del uso de glicerol en condiciones de aerobiosis, aun cuando se hace necesario mejorar la velocidad de producción, especialmente la de ácido succínico; para ello, deberían ser implementadas otras herramientas centradas en el mejoramiento del consumo de sustrato y la exportación de estos compuestos C4.