Actividades enzimáticas de terribacillus SP. AE2B 122 con aplicaciones medioambientales

Résumé

La búsqueda de nuevas fuentes de energías alternativas, sostenibles y renovables se ha convertido en un área de investigación de gran importancia en los últimos años, debido, entre otras razones, a la previsión de que el petróleo se agote en las próximas décadas. En este sentido, el Biodiésel es una alternativa prometedora al gasóleo, debido a una serie de ventajas respecto al Diésel derivado del petróleo. Actualmente el proceso de producción de Biodiésel que se utiliza a nivel industrial es la metanólisis de aceites (transesterificación) utilizando catalizadores alcalinos (KOH y NaOH). Este proceso de producción no es económicamente rentable, lo que ha llevado a que el desarrollo de nuevas tecnologías alternativas para la producción de Biodiésel, innovadoras, competitivas y respetuosas con el medio ambiente constituya uno de los principales objetivos de los últimos trabajos de investigación. Una de las líneas de investigación más importantes en esta área consiste en el uso de lipasas para la producción de Biodiésel, permitiendo que la “biotecnología enzimática blanca” se introduzca en el sector industrial energético. En este contexto, la primera parte de este trabajo de Tesis Doctoral se centra en la utilización de las lipasas como catalizadores en la producción de Biodiésel, debido a la capacidad de estas enzimas para realizar reacciones de transestereficación de aceites en medios no acuosos. Siguiendo esta línea, se desarrolló un método rápido de selección de microorganismos productores de Biodiésel en una almazara de Écija, basándonos tanto en sus actividades hidrolíticas como en sus actividades transesterificadoras. De los 1.016 microorganismos analizados, dos bacterias presentaron los mejores rendimientos en la producción de FAEs tras la transesterificación de aceite de girasol. Estas bacterias resultaron pertenecer al mismo género, el género Terribacillus, el cual nunca antes había sido descrito como productor de Biodiésel, por lo que se seleccionó una de estas cepas, Terribacillus sp. AE2B 122, para posteriores análisis genéticos y bioquímicos. Adicionalmente, se comprobó mediante cromatografía de gases que el producto de la transesterificación, usando los microorganismos analizados, difería del Biodiésel convencional ya que integraba el glicerol en su composición como MG, lo que podría simplificar el procesamiento de este Biofuel. Se obtuvo la secuencia completa del genoma de Terribacillus sp. AE2B 122 y tras el análisis bioinformático de este genoma se identificaron 8 lipasas/esterasas. De ellas, Tel7 es la única de las candidatas que ha mostrado cierta actividad transesterificadora frente a pNPP. El uso de microorganismos en la biorremediación de metales pesados constituye otra área de gran interés en biotecnología ambiental. Siguiendo la línea de este trabajo en cuanto a la búsqueda de nuevas actividades de microorganismos de interés ambiental de esta tesis, la segunda parte se desarrolla en el contexto de la contaminación ambiental por metales pesados. En primer lugar, se realizó el estudio in silico de los genes presentes en el genoma de Terribacillus sp. AE2B 122 relacionados con la resistencia a metales pesados y metaloides. Para realizar este análisis se utilizaron herramientas bioinformáticas (BLAST y EXPASY) y se realizaron ensayos de resistencia de la bacteria a estos metales en medio líquido. De los metales analizados, nos centramos en el estudio de la resistencia a arsénico al comprobar que Terribacillus sp. AE2B 122 exhibía una disposición singular de los genes homólogos a los genes responsables de la resistencia a arsénico en su genoma. Los genes de resistencia a arsénico suelen co-transcribirse formando un operón, siendo generalmente la combinación mínima de genes arsRBC (ej.: E. coli, P. fluorescens, Staphylococcus). En el caso de Terribacillus sp. AE2B 122, el gen homólogo para la reductasa de As(V) arsC, no se localiza en el genoma junto a ninguno de los otros genes responsables de la resistencia a arsénico (arsB y arsR). El análisis de la expresión de estos genes mediante RT-qPCR, mostró que la expresión de uno de los genes homólogos a arsB y uno de los homólogos a arsR, que se localizan contiguos en el genoma de la bacteria, era inducible por As(V). Además, se llevaron a cabo estudios de complementación heteróloga del mutante E. coli AW3110 (ΔarsRBC::cam) con los genes homólogos a arsB y arsC de Terribacillus sp. AE2B 122 y se comprobó que la sensibilidad a As(III) del mutante se complementaba con uno de los genes homólogos de la bomba de As(III) arsB. La complementación de la sensibilidad a As(V) de E. coli AW3110 no fue tan clara, pudiendo deberse a que ninguna de las enzimas reductasas analizadas funcionen como tal, lo que podría significar que la resistencia a As(V) de la bacteria estudiada se deba a otro mecanismo de resistencia no relacionado con la reducción, como la eliminación directa del As(V) sin reducir, su unión a glutatión o chaperonas en el espacio intracelular o respuesta a estrés oxidativo.