Efectos inmunomoduladores del péptido bioactivo NAP y evaluación terapéutica en la inflamación

  1. Fernández Montesinos, Rafael
Supervised by:
  1. David Pozo Pérez Director
  2. Amparo Gomez Pascual Tutor

Defence university: Universidad de Sevilla

Fecha de defensa: 08 October 2013

Committee:
  1. Juan Ramón Calvo Gutiérrez Chair
  2. Víctor Sánchez-Margalet Secretary
  3. Abdelkrim Hmadcha Committee member
  4. Ignasi Barba Vert Committee member
  5. Francisco Martín Committee member

Type: Thesis

Teseo: 349419 DIALNET

Abstract

Introducción: La inflamación es un proceso cuyo fin es preservar la vida, como se deduce de los resultados que describen el alto riesgo de contraer infecciones graves de los individuos con deficiencias en genes relacionados con el evento inflamatorio. Por tanto, el control de la magnitud de la respuesta es fundamental, ya que las actuaciones excesivas o por encima de cierto umbral pueden causar daños irreparables, como ocurre en enfermedades como la artritis reumatoide, la enfermedad de Crohn, la ateroesclerosis, la diabetes, la enfermedad de Alzheimer, la esclerosis múltiple o la isquemia cerebral, entre otras. Es más, si la inflamación se expande al torrente sanguíneo, como ocurre en la sepsis y el shock séptico, las consecuencias pueden ser catastróficas, resultando la respuesta inflamatoria más peligrosa que el estímulo inicial (Nature. 2008; 454(7203):428 Medzhitov R.) La sepsis humana es una enfermedad compleja con numerosas variables que dificultan su clasificación; por lo tanto, se desarrollaron varios modelos animales para abordar el estudio de esta patología. De hecho, estos modelos sirven como base preliminar para el ensayo de agentes terapéuticos, previos a los ensayos clínicos en humanos (J Clin Invest. 2003; 112(4):460 Riedemann NC.), y por lo tanto contribuyen directamente al conocimiento sobre los mecanismos del SI durante las infecciones sépticas (Nat Rev Drug Discov. 2005 ;4(10):854 Buras JA.). En la enfermedad de Crohn las células Th1 activadas promueven una respuesta exacerbada de los macrófagos y la infiltración de neutrófilos, dando lugar a una mucosa intestinal en estado muy grave e inflamada, caracterizada por la producción incontrolada de citoquinas y quimioquinas inflamatorias (Strober, Fuss et al. 2002). Los mediadores solubles IL-6, IL-1ß IL-12, TNF-¿ y NO producidos por las células infiltrantes y los macrófagos residentes, desempeñan un papel crítico en la destrucción de tejido colónico (Annu Rev Immunol. 2002; 20:495 Strober W.) La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad crónica autoinmune que afecta principalmente a las articulaciones pequeñas de manos y pies, y sus tejidos circundantes. Esta enfermedad se caracteriza por una crónica y progresiva inflamación simétrica de la membrana sinovial (sinovitis) y el consecuente deterioro del cartílago y del hueso. En última instancia, se produce la destrucción de la articulación (Nature. 2003; 15;423(6937):356 Firestein GS.). La producción de mediadores proinflamatorios como IL-1ß, TNF-¿ e IL-6 por parte de los sinoviocitos y células infiltrantes induce la síntesis y secreción de enzimas que degradan la matriz extracelular. De esta forma, el Colageno tipo II (CII) y otras proteínas de la matriz degradada aumentan la cantidad del autoantígeno libre en la articulación, activando a los linfocitos T específicos de CII y otras proteínas de la matriz. El resultado final es la destrucción de la articulación por las 2 células y moléculas efectoras del sistema inmunológico (Autoimmun Rev. 2007; 7(1):65 Cho YG.). Si bien muchos de tratamientos resultan prometedores en las terapias relacionadas con las enfermedades inflamatorias, ninguno está exento de efectos secundarios; como es el caso de las terapias que bloquean a IL-6 o TNF¿, que aumentan el riesgo de infecciones y de linfomas en el paciente, o como el tratamiento con anticuerpos contra CD20 que incrementa el riesgo de infarto de miocardio (Expert Rev Clin Immunol. 2010; 6(4):621 Bewtra M. Rheumatology (Oxford). 2011; 50(3):552 Campbell L. Curr Pharm Des. 2013 van Sijl AM.). Por tanto, las actuales terapias resultan, en el mejor de los casos, sólo parcialmente eficientes en una proporción de los pacientes. Resulta de vital importancia la búsqueda de nuevas terapias para el tratamiento de estas enfermedades de forma personalizada (Nat Med. 2012; 6;18(1):59 Steinman L.). Diversos neuropéptidos asociados a propiedades inmunomoduladoras se han caracterizado en los últimos años como candidatos para modular las respuestas inmunológicas en los desórdenes inflamatorios y autoinmunes. El péptido intestinal vasoactivo (VIP), la adrenomedulina, la grelina, la urocortina y la cortistatina son neuropéptidos que no presentan homología entre sí y difieren tanto en las fuentes celulares como en las funciones neuroendocrinas que desempeñan. Sin embargo, estos neuropéptidos comparten ciertas características que los convierten en instrumentos eficaces para restablecer la homeostasis inmunológica (Neuroimmunomodulation. 2010; 17(3):161 Gonzalez-Rey E.). El adnp (activity-dependent neuroprotective protein) es un gen activado durante el proceso neuroprotector e inmunomodulador iniciado por la acción del neuropéptido VIP (J Neurochem. 1999; 72(3):1283 Bassan M.). Gracias a el uso de análogos específicos del VIP para los receptores VPAC1, VPAC2 y PAC1 se descubrió que los cambios inducidos por el VIP en la expresión de ADNP en los astrocitos se producían a través del receptor VPAC2. En modelos animales de daño cerebral provocado por traumatismo cráneoencefálico se produce un incremento en la expresión de ADNP veintinueve días después de que se haya producido el daño. Por tanto parece ser parte de un mecanismo endógeno de compensación en lesiones cerebrales (J Mol Neurosci. 2004; 24(2):181 Zaltzman R.). Además, la exposición a etanol, en un modelo del síndrome de alcohol fetal (más conocido por sus siglas en inglés FAS de fetal alcohol syndrome), aumento la expresión del ADNP embrionario y decidual en 24 horas y persistió en el embrión hasta 10 días. Estos hallazgos sugieren que ADNP puede ser activado como un mecanismo de protección en el FAS (Am J Obstet Gynecol. 2003; 189(3):790 Poggi SH.). El descubrimiento del octapéptido NAPVSIPQ (NAP) tuvo lugar simultáneamente al de ADNP en el artículo publicado por Bassan en el Journal of Neurochemistry en 1999. La nueva proteína caracterizada ¿ADNP- se denominó ¿activity-dependent neuroprotective protein¿ por contener este potente péptido neuroprotector, ya que se demostró que es un péptido que evita la muerte neuronal asociada al bloqueo eléctrico por tetrodotoxina y la excitotoxidad provocada por NMDA (J Neurochem. 1999; 72(3):1283 Bassan M.). 3 El proyecto de investigación trata de evaluar el potencial anti-inflamatorio e inmunomodulador del péptido bioactivo NAP. Representa la primera caracterización funcional de NAP sobre el sistema inmune. Para ello se exploran en los modelos animales de endotoxemia letal, colitis, artritis experimental y neuroinflamación aguda. Además se realizaron aproximaciones experimentales que estudian el papel de ADNP/NAP en poblaciones celulares de la inmunidad innata y adaptativa. Ante la imposibilidad de estudiar la función inmunológica de ADNP mediante el uso de ratones Knock Out, ya que fallecen en la fase de gestación por defectos en la formación del tubo neural (Brain Res Dev Brain Res. 2003 12;144(1):83-90. Pinhasov A.), se emplearon para este estudio ratones heterocigotos para adnp frente al estímulo inmunológico provocado por la neuroinflamación aguda mediada por LPS. Este estimulo provoca la activación de las células de sistema inmunológico propio del SNC facilitando el estudio de la actividad inmunológica de ADNP en el SNC. Resultados: En el estudio del efecto inmunomodulador de NAP en la endotoxemia letal, los ratones inyectados vía intraperitoneal con LPS y tratados con el biopéptido NAP mejoraron el pronóstico letal del modelo, aumentando considerablemente el porcentaje de supervivencia. Además el estudio de los componentes moleculares solubles (citoquinas y quimioquinas) y celulares reveló que el efecto inmunológico de NAP disminuye la respuesta innata disparada por el estimulador inmunológico LPS. La infiltración de neutrófilos en los órganos diana se determinó midiendo la actividad de MPO en extractos de proteína obtenidos 6h después de la inyección de LPS desvelando un descenso de la infiltración en ratones tratados con NAP. El tratamiento con NAP protege contra la colitis aguda inducida por DSS inhibiendo la infiltración de células inmunocompetentes en el tejido inflamado. El Péptido NAP posee un efecto modulador del péptido NAP en la producción de mediadores proinflamatorios en ratones con colitis inducida por la administración de TNBS. También se estudió el efecto inmunoregulador de NAP en el modelo de artritis inducida por el colágeno. En este modelo de autoinmunidad demostramos un efecto regulador de los distintos niveles inmunológicos implicados en el desarrollo patológico de la autoinimunidad, ya que la sintomatología asociada a dicho modelo es aliviada por el efecto de NAP. Además, demostramos e efecto modulador del péptido NAP en la producción de mediadores proinflamatorios en ratones en la artritis inducida por el colágeno. El estudio del efecto modulador del péptido NAP in vivo en la respuesta específica de los linfocitos T de los ganglios linfáticos procedentes de ratones con colitis inducida por TNBS demostró que NAP mejora el desarrollo patológico de la artritis experimental mediante la reducción de la respuesta de las células T autoreactivas y/o la migración de estas células a las articulaciones. Además, las células extraídas de órganos linfoides mesentéricos de ratones con artritis inducida tratados con NAP muestran una proliferación menor, y producen bajos niveles de citoquinas tipo Th1, incluso después de la estimulación ex vivo con PMA y ConA. 4 El análisis de la acción inmunomoduladora del péptido NAP en macrófagos, demostró que NAP inhibe la producción de mediadores proinflamatorios en los macrófagos peritoneales aislados de ratones sépticos y de ratones con colitis inducida por TNBS, y en los macrófagos del bazo aisladas de ratones con colitis inducida por TNBS. La expresión y la secreción de las citoquinas proinflamatorias en respuesta a la neuroinflamación aguda inducida por LPS es menor en ratones tratados con NAP. Además, la producción de IL-10, citoquina antiinflamatoria, es mayor en los ratones tratados con NAP. Tambien se estudió la regulación de la expresión de quimioquinas y receptores de quimioquinas y se demostró la disminución en la movilización y atracción de células inmunocompetentes hacia el foco inflamatorio en los ratones tratados con el péptido NAP. En el análisis histológico del cerebro de ratones con neuroinflamación aguda inducida por LPS se observó un menor acúmulo de células inmunocompetentes en las regiones de cerebrales periféricas: meninges y ventrículos. En el estudio de la función inmunológica de ADNP, observamos que la respuesta inflamatoria en el cerebro de ratones adnp +/- con neuroinflamación inducida por LPS existía un aumento significativo en la producción de IL-6 y en la expresión de ARNm IL-6. Además, se demostró que la deficiencia de adnp producía una regulación diferencial de la expresión de receptores de quimioquinas en ratones adnp+/- durante el proceso inflamatorio cerebral inducido por LPS. Aunque no se observó diferencias en la expresión de receptores los Toll en los ratones adnp+/-. Discusión: En los estudios realizados en este proyecto de investigación, comprobamos la capacidad de NAP para evitar la expresión exacerbada de citoquinas proinflamatorias y que es realmente útil para evitar consecuencias posteriores graves. Parece por tanto que estas consecuencias mejoran por la acción de NAP sobre la expresión de citoquinas proinflamatorias, esta capacidad se adapta perfectamente a la patogénesis de los procesos sistémicos de la sepsis, la colitis experimental inducida, la artiritis reumatoide experimental y la neuroinflamación aguda inducida por LPS, ya que se conoce que la mayoría de los efectos dañinos son provocados por la excesiva respuesta del sistema inmunológico innato (citoquinas proinflamatorias) y sus mecanismos de defensa (infiltración de neutrofilos). NAP al evitar esta génesis patológica por parte del sistema inmunológico provoca un pronostico favorable para los ratones tratados con NAP en los modelos inflamatorios estudiados. Además, la disminución de los mediadores del proceso inflamatorio podría ser la consecuencia de una disminución de la infiltración de células inflamatorias en la mucosa colónica y sinovial. Sin embargo, comprobamos que NAP inhibe la producción de mediadores proinflamatorios en cultivos de macrófagos peritoneales procedentes de ratones endotoxémicos y en cultivos de macrófagos activados aislados de ratones con colitis, es una evidencia en contra de esta hipótesis. Esto sugiere que, además de la reducción de la infiltración inflamatoria, NAP desactiva la respuesta inflamatoria en la artritis inducida y colitis experimental, y que la desactivación de macrófagos residentes e infiltrados podría ser un mecanismo clave involucrado en su acción. 5 Los ratones heterocigotos para adnp mostraron una expresión y liberación mayor de IL-6 sin embargo no apreciamos diferencias en la expresión de TNF¿. Como comentamos anteriormente NAP, octapéptido integrado en ADNP, fue capaz de inhibir la expresión de IL-6 en macrófagos y además fue capaz de inhibir la expresión de TNF¿ en un modelo de traumatismo craneoencefálico severo. Por tanto ADNP debe de estar implicado en la regulación endógena de la expresión de IL-6, aunque no podemos decir lo mismo de TNF¿ debido quizás a las limitaciones del modelo heterocigoto. Aunque en estadios tempranos del proceso neuroinflamatorio la presencia de células inmunocompetentes procedentes de la sangre es escasa en el parénquima cerebral, existe un acumulo importante de estas células en las regiones en contacto con el LCR del cerebro, como las meninges y los ventrículos ya que la administración de LPS en el ventrículo garantizaba la difusión del estímulo inmunológico por las cavidades cefalorraquídeas. La determinación de la expresión de CD3, marcador molecular de linfocitos T, denoto el aumento del acumulo de células T en los cerebros de los ratones heterocigotos para adnp. Esto es una consecuencia de la perturbación del estado inmunoregulador propio del SNC provocado por el aumento en la activación de la microglía en los ratones con déficit de ADNP. Conclusión: En resumen, este trabajo identifica al péptido NAP como un nuevo factor inmunomodulador con la capacidad de desactivar la respuesta inflamatoria y proporciona un potente fundamento para la evaluación de la eficacia de NAP como un novedoso agente terapéutico para el tratamiento de los trastornos inflamatorios. El futuro trabajo debe abordar las cuestiones de si ADNP se podría considerar una nueva proteína neuroinmunológica reguladora que podría ser útil para el desarrollo de nuevas terapias para trastornos inflamatorios y del estudio de la producción de ADNP por células inflamatorias que participan en el efecto beneficioso de VIP en trastornos inmunitarios. Referencias: Nature. 2008; 454(7203):428 Medzhitov R. J Clin Invest. 2003; 112(4):460 Riedemann NC Nat Rev Drug Discov. 2005 ;4(10):854 Buras JA Annu Rev Immunol. 2002; 20:495 Strober W.) Nature. 2003; 15;423(6937):356 Firestein GS Autoimmun Rev. 2007; 7(1):65 Cho YG Expert Rev Clin Immunol. 2010; 6(4):621 Bewtra M. Rheumatology (Oxford). 2011; 50(3):552 Campbell L. Curr Pharm Des. 2013 van Sijl AM Nat Med. 2012; 6;18(1):59 Steinman L. Neuroimmunomodulation. 2010; 17(3):161 Gonzalez-Rey E J Neurochem. 1999; 72(3):1283 Bassan M J Mol Neurosci. 2004; 24(2):181 Zaltzman R. Am J Obstet Gynecol. 2003; 189(3):790 Poggi SH Brain Res Dev Brain Res. 2003 12;144(1):83-90. Pinhasov A.