Estudio del modo de acción de los metabolitos secundarios trans-cinamaldehído y norharmano sobre el metabolismo vegetal

Resumen

El control de las malas hierbas es una de las grandes preocupaciones de los agricultores en la actualidad, ya que de ello depende la obtención de una alta producción de alimentos de buena calidad. Este control ha ido evolucionando con el paso de los años, desde un manejo manual, en el cual el agricultor quitaba una a una las malas hierbas de su parcela; pasando por la mecanización del trabajo, con el empleo de gubias, desbrozadoras, tractores, etc.; y alcanzando la forma más efectiva hasta la fecha, que es el control químico mediante el uso de herbicidas sintéticos, productos muy baratos y de alta eficacia, como por ejemplo el 2,4-D, uno de los primeros herbicidas empleados en la historia, que permitía tratar grandes áreas de campo con dosis relativamente bajas y de forma económicamente asequible para los agricultores. Sin embargo, estos productos conllevan a la larga problemas muy graves, como son la contaminación del medio ambiente y la aparición de malas hierbas resistentes a estos productos. Estas resistencias se originan debido a la presión de los herbicidas sobre un número limitado de dianas moleculares, ya que, en las últimas décadas, no han aparecido nuevos modos de acción de los herbicidas comerciales, apareciendo a veces incluso malas hierbas que presentan resistencia a múltiples modos de acción. Por tanto, el descubrimiento de alternativas a estos productos es un asunto de alta prioridad, ya que se necesitan compuestos con nuevos modos de acción que no sean tan perniciosos para la salud de los ecosistemas y los seres que en ellos habitan, incluidos los seres humanos. Los productos naturales son una gran fuente de moléculas estructuralmente muy diversas, lo cual puede solucionar el problema de la aparición de resistencias, ya que, además, en muchos casos estos compuestos pueden presentar múltiples modos de acción, actuando sobre varias dianas a la vez, lo que dificulta aún más la aparición de malas hierbas resistentes. Además, por su origen natural, son a priori más respetables con el medio ambiente y suelen presentar una vida media corta, por lo que se degradarían con mayor facilidad. Estos productos de origen natural pueden ser organismos vivos, como microorganismos, hongos o plantas, o bien moléculas derivadas de su metabolismo, como son los metabolitos secundarios, que suelen participar en procesos que no son vitales para el organismo que los produce, pero sí les confiere una ventaja adaptativa en el ecosistema en el que se desarrolla. Dado este escenario, esta Tesis de Doctorado se ha centrado en el estudio del potencial fitotóxico de metabolitos secundarios de origen vegetal y en su modo de acción, buscando algún modo de acción novedoso o, simplemente, buscando compuestos naturales de carácter herbicida que puedan sustituir en los agroecosistemas a los productos de origen sintético, en la búsqueda de una solución más amistosa con el medio ambiente frente al problema de las malas hierbas en la agricultura. La elección de estos metabolitos se basó en una búsqueda bibliográfica de diferentes compuestos con diversas actividades biológicas (bactericida, fungicida, insecticida, etc.) demostradas sobre diversos organismos, pero de cuya actividad fitotóxica no se tenía constancia hasta el momento. Los compuestos elegidos fueron los metabolitos secundarios norharmano y trans-cinamaldehído, los cuales pueden encontrarse en diferentes organismos vegetales terrestres y acuáticos. El norharmano (9H-pirido[3,4-b]indol) es un alcaloide obtenido a partir de la fusión de una piridina y un grupo indol. Puede encontrarse de forma natural en diferentes organismos vegetales, como plantas terrestres de las familias Gramineae, Sapotaceae y Zygophyllaceae, pero también en organismos acuáticos dinoflagelados o cianobacterias, e incluso en alguna especie de hongo. Se conoce que el norharmano posee diversas actividades biológicas como alguicida, antibacteriano, anticianobacteriano. Además, como la gran mayoría de los alcaloides, este compuesto presenta numerosos efectos farmacológicos como inhibidor enzimático, inductor de apoptosis o por presentar actividad comutagénica. En cuanto a su efecto sobre organismos vegetales, se conoce su efecto alelopático sobre algunas cianobacterias y algas verdes, pero nada sobre su efecto en plantas superiores. Por su parte, el trans-cinamaldehído (trans-3-fenilprop-2-enal) es un fenilpropanoide agrupado históricamente dentro de los compuestos fenólicos. Puede encontrarse con frecuencia en plantas pertenecientes a la familia Lauraceae, más concretamente en plantas del género Cinnamomum, siendo el componente mayoritario del aceite de canela, lo cual hace de este compuesto que sea empleado con frecuencia por la industria alimentaria (en productos como chicles, helados, etc.) o cosmética (sobre todo en perfumes). Además, este metabolito presenta diferentes actividades biológicas como bactericida, insecticida, fungicida, etc. y diversos estudios han demostrado que puede tener efectos antinflamatorios, protectores del sistema cardiovascular e incluso anticancerígeno. A pesar de todo ello, se desconoce su posible modo de acción sobre plantas superiores. Dada esta situación, en esta Tesis de Doctorado se plantean como objetivos principales estudiar el potencial fitotóxico de estos compuestos y su modo de acción, tanto sobre el metabolismo de plántulas como de plantas adultas de la especie modelo Arabidopsis thaliana, además de determinar su especificidad sobre diferentes especies de cultivo ampliamente extendidas y sus malas hierbas asociadas más comunes para establecer en qué sistemas agrícolas es más aconsejable el uso de estos metabolitos como candidatos a nuevos bioherbicidas. Para alcanzar los objetivos planteados en esta Tesis Doctoral se han realizado diversos experimentos para intentar demostrar y establecer la posible toxicidad de estos dos compuestos sobre el metabolismo vegetal y descubrir cuál es su modo de acción, o en otras palabras, conocer qué procesos fisiológicos se ven afectados y cómo se ven alterados. En lo que respecta al estudio del potencial fitotóxico y el modo de acción del metabolito secundario norharmano (NOR), se realizaron primeramente curvas dosis-respuesta para los procesos germinativos y de crecimiento radicular en plántulas de A. thaliana con el objetivo de conocer las concentraciones inhibitorias de referencia, IC50 e IC80 (concentraciones que provocan un 50 y un 80% de inhibición, respectivamente, de cada uno de los procesos). Se pudo observar cómo el crecimiento radicular era más sensible al norharmano que la germinación, obteniéndose valores de IC50 e IC80 tan bajos como 62 y 153 µM, respectivamente. Para un análisis más detallado, las plántulas se trataron con la IC50 a los 7 y 14 días con el fin de observar su estructura y ultraestructura al microscopio óptico y electrónico respectivamente. Estos ensayos mostraron que el NOR provoca alteraciones en los planos de división celular, con paredes irregulares y algunas de ellas sin terminar, y originando en ocasiones la aparición de células multinucleadas. Además, las plántulas tratadas con NOR durante 7 días no presentaron amiloplastos en los ápices radiculares. En cuanto a la morfología macroscópica, pudo observarse cómo el compuesto provocó diferentes alteraciones en la morfología radicular de las plantas en función de la concentración ensayada, como la aparición de pelos radiculares ectópicos o fenómenos de torsión en las concentraciones intermedias, o síntomas de necrosis a partir de la concentración 200 µM. Una de las alteraciones morfológicas más destacables fue la presencia de raíces adventicias con valores de NOR tan bajos como 62 µM, que además fueron más abundantes a la concentración de 153 µM. Esta morfología observada, sospechosa de un posible desbalance de alguna de las fitohormonas que rigen la arquitectura radicular, más concretamente de las auxinas, fue lo que llevó a realizar un ensayo con el compuesto antiauxínico PCIB, el cual demostró la existencia de una alteración en la síntesis o distribución de esta hormona. Para profundizar más en cómo el norharmano afecta al balance de auxinas, se realizó una cuantificación en las plantas tratadas para comprobar si el efecto del NOR se dirige a la síntesis de auxinas, y se emplearon diferentes líneas transgénicas GFP (Green Fluorescent Protein, de sus siglas en inglés) para varias de las proteínas transportadores de auxinas, las proteínas PIN, con el fin de observar si el norharmano afecta al transporte polar de esta fitohormona. Estos ensayos confirmaron que el norharmano afecta a la disposición de las proteínas PIN 2, PIN 3 y PIN 7, lo que puede provocar una distribución desigual de las auxinas y ser la razón de la aparición de las raíces adventicias observadas. Además, esta alteración puede provocar un desajuste en los microtúbulos, tal y como sugiere la torsión observada en las raíces y los planos de división alterados que pudieron observarse en los análisis estructurales y ultra-estructurales, y que fue confirmado a través de la detección de microtúbulos mediante inmunofluorescencia. Esta alteración de los microtúbulos podría ser la responsable de la disminución observada en la elongación radicular y de la consiguiente reducción en el crecimiento radicular. Una vez determinada la fitotoxicidad del norharmano en plántulas (14 días), el siguiente paso fue conocer si el compuesto también era capaz de alterar el metabolismo de plantas adultas de A. thaliana, así como comprobar mediante diferentes ensayos si el compuesto presenta especificidad frente a cultivos y las principales malezas asociadas a los mismos. En primer lugar, se analizó la especificidad del norharmano sobre diversos cultivos de interés agrícola para determinar en qué agroecosistemas podría ser beneficioso su uso para el control de las malas hierbas. Las especies ensayadas fueron las especies de cultivo Zea mays L. (maíz), Triticum aestivum L. (trigo), Oryza sativa L. (arroz) y Lactuca sativa L. (lechuga) y algunas de las malas hierbas más comunes asociadas a estos cultivos, como fueron Amaranthus retroflexus L. (amaranto), Echinochloa crus-galli L. (pasto de corral), Plantago lanceolata L. (alpiste), Portulaca oleracea L. (verdolaga común) y Avena fatua L. (avena salvaje). También se ensayó este compuesto sobre una mala hierba muy presente en los campos de cultivo de España como es Erigeron bonariensis. Para ello, se realizaron curvas dosis respuesta de cada especie para los procesos de germinación y crecimiento radicular, de tal manera que nos permita establecer si el compuesto es más efectivo cuando es empleado en preemergencia (control de la germinación) o posemergencia (control del crecimiento). Los resultados obtenidos demostraron que el norharmano presenta especificidad para las especies ensayadas, siendo un potencial controlador de la germinación de A. fatua y P. lanceolata en campos de trigo, además de ser capaz de controlar el crecimiento de malas hierbas en los sistemas agrícolas de Z. mays - E. crus-galli, Z. mays - P. oleracea y Z. mays - A. retroflexus, así como en los agroecosistemas O. sativa - E. crus-galli y O. sativa - P. oleracea. Además, en cuanto a su efecto sobre E. bonariensis, el norharmano tuvo un efecto estable a lo largo de su uso frente a esta especie, tanto cuando fue ensayado en preemergencia como en posemergencia. Además de estos estudios sobre diversas especies de cultivos y malas hierbas, también se estudió el efecto del norharmano sobre el metabolismo de plantas adultas de A. thaliana mediante la aplicación del compuesto de dos formas diferentes, riego y pulverización, dado que se desconoce la capacidad de translocación del NOR vía xilema o floema en el interior de las plantas tratadas. De los dos modos de empleo utilizados, solo se obtuvieron efectos inhibitorios cuando el norharmano fue aplicado mediante riego, provocando una disminución del tamaño de las plantas tratadas, así como la aparición de zonas cloróticas y violáceas en las hojas. Las medidas de fluorescencia de clorofila a demostraron que el norharmano provoca un aumento en la energía disipada de forma no regulada como fluorescencia (ΦNO) y un descenso en los parámetros ETR, ΦII y Fv/Fm. Dicha situación, junto con las diferentes medidas poscosecha realizadas, como fueron el aumento en el contenido de antocianinas, la disminución en el contenido de proteínas totales, la bajada del potencial hídrico y el aumento de la ratio PS/PF, demuestran cómo este metabolito secundario provoca un estrés hídrico en las plantas tratadas, cuando era aplicado mediante riego, que ocasiona alteraciones en la fase bioquímica y fotoquímica de la fotosíntesis que acaban por provocar alteraciones del aparato fotosintético, lo que se tradujo en la reducción del crecimiento observada. Una vez entendido cómo el norharmano actúa sobre el metabolismo de plántula y de planta adulta, además de demostrar su especificidad frente a diversas especies de cultivos y malas hierbas, se realizaron ensayos similares con el metabolito secundario trans-cinamaldehído, para ver cómo este compuesto afecta al metabolismo vegetal. Al igual que con el norharmano, se realizaron curvas dosis-respuesta con diferentes concentraciones de trans-cinamaldehído (TC) para los procesos de germinación y crecimiento radicular y se observó la morfología de plántulas de A. thaliana bajo esas concentraciones. Al igual que se observó para el NOR, para el TC también se observó una mayor sensibilidad de sus efectos sobre el crecimiento radicular que sobre la germinación, obteniéndose valores de IC50 e IC80 de 46 y 87 µM, respectivamente, incluso más bajas que las encontradas para el NOR. Tras tratar las plántulas de A. thaliana con la IC50 de trans-cinamaldehído, para observar las posibles alteraciones que este metabolito secundario pueda tener sobre la estructura y la ultraestuctura radicular, se observó una desorganización celular evidente en la caliptra, encontrando en los estudios de microscopía electrónica (TEM) cómo a los 7 días de tratamiento con el TC, hay un elevado número de mitocondrias, muchas de ellas en división, mientras que a los 14 días, lo que más llama la atención es la presencia de células muy vacuolizadas con aparatos de Golgi muy activos, lo cual se reflejó en el elevado número de vesículas que pudieron apreciarse en el citoplasma. La morfología de las plántulas observadas fue muy similar al de las plántulas tratadas con norharmano, con raíces más cortas con pelos radiculares abundantes y en posiciones ectópicas, además de la presencia de raíces adventicias. Esto llevó a pensar, al igual que con el norharmano, que podía existir un posible desbalance a nivel hormonal de las auxinas, lo cual fue comprobado por medio de un bioensayo con el antiauxínico PCIB. Este desbalance, al contrario que con el norharmano, se produjo por un aumento en la síntesis de auxinas, acompañado además de un fuerte incremento en el contenido de ácido benzoico y de un aumento del ácido salicílico. El aumento de las auxinas y del ácido benzoico podría estar relacionado con un aumento de las enzimas oxidasa participantes en sus rutas de síntesis, que generaría un estrés oxidativo. Este estrés oxidativo fue confirmado mediante la detección in vivo de las especies reactivas de oxígeno (ROS, de sus siglas en inglés) anión superóxido (O2-) y peróxido de hidrógeno (H2O2). Estas moléculas se encuentran en mayor cantidad en las plántulas tratadas con el metabolito secundario trans-cinmaldehído, y son las encargadas de provocar las alteraciones en el crecimiento observadas en las plántulas tratadas, además de las alteraciones a nivel ultraestructural observadas, como son el aumento en el número de mitocondrias debido a un mal funcionamiento de las mismas, confirmado tras una determinación del potencial de membrana mitocondrial, lo cual podría llevar en casos extremos a procesos de muerte celular programada. Visto que el trans-cinamaldehído presenta un potencial fitotóxico en plántulas de A. thaliana, induciendo un estrés oxidativo en las mismas, el siguiente paso fue observar si el compuesto también es capaz de alterar el metabolismo de plantas adultas, además de determinar su especificidad frente a diferentes especies de cultivos y malas hierbas asociadas, de la misma forma que se realizó con el norharmano. Para ello, se realizaron en primer lugar bioensayos de pre y posemergencia con diferentes concentraciones de trans-cinamaldehído sobre las especies de cultivo Zea mays L. (maíz) y Lactuca sativa L. (lechuga) y sobre las malezas asociadas a los mismos Amaranthus retroflexus L. (amaranto), Echinochloa crus-galli L. (pasto de corral) y Plantago lanceolata L. (alpiste). Este metabolito secundario resultó muy eficaz para el control del crecimiento radicular de las tres malas hierbas ensayadas en campos de maíz, ya que no solo inhibe el crecimiento de estas malezas, sino que además es capaz de estimular el crecimiento del maíz a bajas concentraciones. En cuanto a su uso como controlador de la germinación, solo fue capaz de inhibir la germinación de A. retroflexus, por lo que podría emplearse en los agroecosistemas de Z. mays - A. retroflexus, ya que no afecta a la germinación del maíz. En cuanto a su efecto sobre el metabolismo de plantas adultas de A. thaliana, sorprendentemente ninguna de las concentraciones ensayadas (87, 175, 300 y 700 µM) provocó efectos inhibitorios en el crecimiento de plantas regadas o pulverizadas con trans-cinamaldehído, es más, los efectos en general fueron neutros o incluso estimulatorios, como pudo observarse en la morfología de las plantas, así como en la medida de los diferentes parámetros relacionados con la fluorescencia de la clorofila a, y en los valores de las medidas poscosecha relacionadas con el estado hídrico de las plantas tratadas, como la ratio PS/PF, el área foliar o la determinación de los potenciales hídrico y osmótico. Todo ello sugiere que el trans-cinamaldehído provoca, a las concentraciones empleadas en este trabajo, un efecto de hormesis en las plantas, estimulando su metabolismo, por lo que sería necesario realizar estos ensayos con concentraciones más altas para poder buscar efectos negativos sobre el metabolismo, ya que en el tratamiento de riego con la concentración más alta ensayada (700 µM), puede observarse un ligero aumento de ΦNO (energía emitida de forma no controlada como fluorescencia) y un pequeño descenso de ΦNPQ (energía emitida de forma controlada como calor), lo que sugiere que la planta está respondiendo frente a algún grado de estrés, y por lo tanto hace pensar que a partir de esta concentración el trans-cinamaldehído podría ser efectivo sobre el metabolismo de plantas adultas de A. thaliana. A partir de los experimentos realizados en esta Tesis Doctoral, se ha podido comprobar que ambos metabolitos secundarios presentan fitotoxicidad sobre plántulas de A. thaliana, y se ha elucidado su modo de acción sobre el metabolismo de esta especie modelo. Además, ambos compuestos presentan especificidad frente a diferentes especies de cultivos y sus malas hierbas asociadas, siendo potencialmente aplicables en diferentes sistemas agrícolas. Sin embargo, el norharmano parece ser más efectivo sobre el metabolismo de plantas adultas de A. thaliana que el trans-cinamaldehído, al menos a las concentraciones ensayadas en este trabajo. Tanto el norharmano como el trans-cinamaldehído aparecen como prometedores controladores del crecimiento vegetal, siendo futuros candidatos para el desarrollo de nuevos herbicidas.