Análisis del papel del as kisspeptinas y del receptor de taquiquininas, tacr2, en el control de la reproducciónnuevas interacciones, mecanismos reguladores e implicaciones metabólicas

Resumen

1. Introducción o motivación de la tesis En mamíferos, la reproducción es una función indispensable para la perpetuación de las especies, y dada su importancia, es asegurada por una red sofisticada de señales reguladoras. El sistema neuroendocrino encargado de controlar esta función es el denominado eje hipotálamo-hipófiso-gonadal o también conocido eje reproductivo1,2. Dentro de este eje, a nivel hipotalámico, las neuronas GnRH son el principal centro de integración de factores tanto endógenos (p. ej. hormonas metabólicas) como exógenos (p. ej. señales nutricionales). A su vez, su actividad secretora es regulada por múltiples señales de origen neuronal y glial. De hecho, para el correcto funcionamiento del eje reproductivo es esencial la secreción pulsátil de GnRH3,4. De entre los numerosos neuropéptidos y transmisores que modulan la actividad neuro-secretora de las neuronas GnRH, las kisspeptinas destacan como reguladores principales. En concreto, las kisspeptinas son una familia de péptidos relacionados, derivados de un precursor común, que realizan su función a través de Gpr54, un receptor acoplado a proteínas G5,6. Las kisspeptinas desempeñan un papel importante en la diferenciación sexual, la pubertad y la secreción pulsátil de gonadotropinas6,7. Sin embargo, el conocimiento que tenemos sobre los mecanismos y dianas de acción de las kisspeptinas requiere de más investigación, siendo de gran interés la identificación de nuevas rutas de señalización y elementos mediadores de las kisspeptinas en el control de la función reproductiva. Por otro lado, las taquiquininas (TACs) son también reconocidas como factores reguladores clave de la secreción de GnRH y de otros aspectos de la función reproductiva, en una estrecha interacción con las kisspeptinas8-10. No obstante, la redundancia y el solapamiento de las distintas taquiquininas (SP, NKA, NKB) y sus receptores (NK1R, NK2R, NK3R), dificulta el estudio individual de cada uno de los elementos de este sistema11. De hecho, el papel de la señalización por el receptor 2 de taquiquininas (NK2R) en el control de la función reproductiva sigue sin ser caracterizado en detalle, a excepción de aproximaciones basadas en estudios farmacológicos o de modelos murinos con eliminación congénita del gen Tac1, que codifica tanto para SP como para el ligando preferencial de NK2R, que es NKA12,13. En base a lo anteriormente expuesto, el objetivo de esta Tesis Doctoral es (i) caracterizar el papel de NK2R en el control de la función reproductiva, mediante estudios en un modelo novedoso de eliminación congénita de Tacr2; y (ii) identificar nuevas dianas mediadoras de los efectos de kisspeptinas en el hipotálamo mediante estudios proteómicos en modelos murinos genéticamente modificados. Por otro lado, derivado de este último, en esta Tesis se pretende igualmente (iii) caracterizar el papel de la señalización por kisspeptina en astrocitos, mediante la generación de un modelo novedoso de eliminación selectiva de Gpr54 en células GFAP-positivas. 2.Contenido de la investigación Esta Tesis Doctoral se ha dividido en tres bloques experimentales principales: En el Bloque Experimental 1, se ha realizado una caracterización fenotípica, farmacológica y comportamental exhaustiva, incluyéndose también análisis histológicos, del modelo de ratón con ablación congénita de Tacr2, denominado Tacr2 KO, para desvelar la implicación de la señalización por NK2R, y su interacción con kisspeptinas, en el control de la función reproductiva. Los estudios farmacológicos iniciales documentaron la capacidad del agonista de NK2R para evocar una respuesta en términos de secreción de LH tras su administración icv en ratones control, en la misma medida que lo hacen los otros agonistas de taquiquininas y la kisspeptina (Kp-10). Estudios farmacológicos similares en el modelo Tacr2 KO no mostraron alteraciones en la respuesta de LH a los agonistas de NK1R y NK3R así como de Kp-10. No obstante, en la respuesta de LH al agonista de NK2R se observó un dimorfismo sexual; esto es, mientras que en hembras la respuesta apareció parcialmente atenuada, en los machos Tacr2 KO esta respuesta estuvo prácticamente conservada, siendo esta última suprimida tras el bloqueo de la señalización por NK3R. La caracterización reproductiva de este modelo reveló que el inicio de la pubertad y la fertilidad no están comprometidas por la ausencia de señalización por NK2R, aunque sí se detectó una tendencia al incremento en el intervalo de cría, así como un deterioro en la función en las células de Sertoli en su interacción con las espermátides en los ratones macho adultos Tacr2 KO, aunque ninguna alteración en ovario ni útero en el caso de las hembras KO. Por otro lado, los ratones hembra Tacr2 KO presentaron niveles basales de secreción pulsátil de LH significativamente bajos, sin cambios aparentes en el número de pulsos de LH. Además, en las hembras Tacr2 KO, no se observó el incremento de los niveles de LH tras dos días después de la ovariectomía (OVX) que sí es detectado en las hembras controles. En estas mismas hembras Tacr2 KO ovariectomizadas, el perfil de temperatura de la cola monitorizado no reveló diferencias con respecto a los controles. En el caso de los machos Tacr2 KO, en condiciones de déficit energético consecuencia de un ayudo de 24 horas de duración, se registraron niveles de LH significativamente más bajos que los de los controles. Por otro lado, los estudios de comportamiento de preferencia por el sexo opuesto y de orina de hembras, en los que se incluye la monitorización de la velocidad y distancia recorrida durante el test, no mostraron ninguna respuesta diferencial entre los ratones KO y los controles. Adicionalmente, se analizaron indicadores metabólicos para valorar el impacto de la ausencia de señalización por NK2R sobre la homeostasis metabólica. Entre ellos la ganancia de peso corporal fue similar entre ratones Tacr2 KO y sus controles. Del mismo modo, los análisis de composición corporal indicaron que no había diferencias en el porcentaje de masa grasa y magra entre KO y controles, ni tampoco en el gasto energético, coeficiente respiratorio, actividad locomotora total y nocturna, ni en los patrones de ingesta durante el día y la noche registrados durante 24 horas. La medida de la presión sanguínea tampoco evidenció diferencias entre animales controles y KO. Finalmente, se observaron niveles basales de glucosa significativamente más elevados en los ratones macho Tacr2 KO tras la exposición crónica de estos a una dieta obesogénica. En el Bloque Experimental 2, se llevaron a cabo una serie de análisis proteómicos, moleculares e inmunohistoquímicos en modelos de ratón modificados genéticamente dirigidos a identificar nuevas dianas de acción de las kisspeptinas. En el primer estudio proteómico realizado en muestras del área preóptica del hipotálamo de ratones deficientes para kisspeptina, Kiss1 KO, inyectados intracerebroventriculamente (icv) con Kp-10, se observó la expresión diferencial de 30 proteínas implicadas en el metabolismo celular y balance energético, señalización celular, plegamiento de proteínas y plasticidad sináptica; identificándose en esta última categoría a la proteína acídica fibrilar glial (GFAP), marcador de astrocitos. En el segundo estudio proteómico, en el que se empleó una tecnología de nueva generación, se detectó de nuevo que la expresión de GFAP y otros indicadores de astrocitos eran modificados en respuesta a la administración de kisspeptina; efecto que fue confirmado también por análisis de RT-qPCR y western blot. A partir de estas evidencias, implementamos una serie de análisis que permitieron demostrar por primera vez en cultivos primarios de astrocitos de rata y ratón la expresión del receptor de kisspeptina, Gpr54. Además, se comprobó que la señalización por kisspeptinas era funcional en estas células. In vivo se detectó la co-expresión de Gpr54 y GFAP en cerebro de ratón, registrándose un enriquecimiento del porcentaje de co-localización Gpr54-GFAP en las áreas hipotalámicas del órgano vascular de la lámina terminal (VOLT) y del área anteroventral periventricular (AVPV). Por último, mediante análisis por inmunohistoquímica se observaron cambios en el marcaje de GFAP en el núcleo arcuato (ARC) en dos modelos de ratón con eliminación congénita de Gpr54, si bien dichos cambios no fueron extensibles a la proteína S100B de unión a calcio, otro marcador de astrocitos. Finalmente, en el Bloque Experimental 3, se llevaron a cabo una serie de estudios fenotípicos y farmacológicos en un modelo novedoso de ratón con deleción selectiva del receptor Gpr54 en células GFAP-positivas, modelo de ratón denominado como G-KiRKO (del inglés GFAP cell-specific Kisspeptin Receptor KO), a fin de caracterizar el papel fisiológico de la señalización por kisspeptinas en astrocitos en el control de la función reproductiva. Primero, se validó el modelo mediante análisis moleculares e inmunohistoquímicos empleando una línea reportera de ratón y cultivos primarios de astrocitos; análisis que confirmaron la eficiente eliminación de Gpr54 de astrocitos. Sin embargo, la eliminación efectiva de la señalización de kisspeptina en astrocitos en el modelo G-KiRKO, no afectó la edad de llegada a la pubertad, ni modificó la secreción de LH ni alteró el ciclo estral en la edad adulta. En cambio, los ratones G-KiRKO presentaron respuestas significativamente aumentadas de LH tras la administración icv de Kp-10. Por otro lado, los ratones G-KiRKO tampoco presentaron alteraciones en parámetros metabólicos como son el peso y composición corporal, pero sí se registró una respuesta glucémica mejorada en el test de sobrecarga de glucosa, sin verse afectada la respuesta a insulina. A su vez, los ratones hembra G-KiRKO mostraron una atenuación del efecto de una dieta obesogénica (HFD) sobre el adelanto de la edad de apertura vaginal, marcador externo de llegada a la pubertad en roedores hembra. No obstante, no se afectó la edad de primer estro, indicador de la primera ovulación en roedores, ni tampoco la edad de la separación balano-prepucial en el caso de los ratones macho. En la edad adulta, solo en el caso de las hembras G-KiRKO se detectó un aumento excesivo de la respuesta de LH tras la administración con Kp-10, que previamente se había observado en condicionales basales. Además, con la exposición a la dieta rica en grasas, el ciclo estral en hembras KO se vio comprometido, registrándose ciclos más largos, con un mayor número de días en la fase de diestro y menos en estro. Por otro lado, los valores de parámetros metabólicos como el peso y la composición corporal en los ratones G-KiRKO fueron comparables a los de los controles. Bajo esta condición de estrés metabólico, solo los machos G-KiRKO mostraron una respuesta glucémica mejorada, similar a la observada en condiciones fisiológicas, sin alteraciones en la respuesta a insulina, y sin diferencias en la respuesta de glucosa ni de insulina entre las hembras controles y G-KiRKO. Por otro lado, los ratones macho G-KiRKO presentaron una respuesta disminuida en términos de inmunoreactividad de GFAP en el ARC tras exposición aguda a HFD. 3.Conclusión Las principales conclusiones de esta Tesis Doctoral son: 1. La eliminación congénita del receptor de taquiquininas, NK2R, receptor preferencial de NKA, causa alteraciones moderadas pero detectables en el funcionamiento del eje reproductivo, evidenciadas por unos niveles basales y medios de LH más bajos, una tendencia al incremento en el intervalo de cría y una función deficiente de las células de Sertoli, junto con una alteración modesta en el control homeostático de la glucosa en condiciones obesogénicas, aunque sin comprometer el éxito reproductivo ni afectar al comportamiento sexual. Los resultados de este estudio ponen de manifiesto un papel moderado de la señalización de NK2R en el control del eje reproductivo, en el que se aprecia la redundancia y solapamiento entre los receptores de taquiquininas en la regulación de la función reproductiva. 2. Los datos obtenidos en este estudio documentan por primera vez la capacidad de kisspeptinas de inducir una respuesta en las células hipotalámicas de la glía, además de identificar la presencia de su receptor en astrocitos y la funcionalidad de este, a través de rutas de señalización en las que interviene ERK, y en las que se regula la expresión de marcadores gliales. La eliminación eficiente de la señalización de kisspeptina en astrocitos in vivo conlleva ligeras alteraciones del funcionamiento del eje reproductivo en condiciones basales, evidenciadas por una mayor secreción de LH en respuesta a kisspeptina, pero en condiciones obesogénicas, se hacen evidentes alteraciones en la edad de llegada a la pubertad y del ciclo estral en ratones hembras deficientes en la señalización de kisspeptina en astrocitos, así como una respuesta atenuada de la reactividad de astrocitos tras una exposición aguda a una dieta rica en grasas. 4. Bibliografía 1. Fink, G. in Neuroendocrinology in Physiology and Medicine (eds. Conn, P. M. & Freeman, M. E.) 14, 107–133 (Humana Press, 2000). 2. Schwartz, N. B. in Neuroendocrinology in Physiology and Medicine (eds. Conn, P. M. & Freeman, M. E.) 139, 135–145 (Humana Press, 2000). 3. Carmel, P. W., Araki, S. & Ferin, M. 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