Aplicación de la proteómica a la caracterización de mecanismos de patogenicidad en Botrytis CinereaUtilización y evaluación de nuevos fungicidas

Resumo

La presente memoria de Tesis Doctoral consta de tres trabajos de investigación. En el primero de ellos, se realizó la optimización del protocolo para la obtención y estudio del proteoma de B. cinerea con el objetivo de determinar un perfil proteómico de referencia que nos permita caracterizar las proteínas mayoritarias presentes en el hongo en condiciones de cultivo estándar, determinar si alguna de estas proteínas están relacionadas con la patogenicidad y bscar aquellas proteínas susceptibles de convertirse en dianas terapéuticas para el diseño de nuevos fungicidas. Para ello, se compararon distintos protocolos de extracción y solubilización de las proteínas del hongo. La solubilización de proteínas de tampón fosfato y posterior precipitación mediante acetona y ácido tricloro acético resultó ser el mejor de los métodos ensayados. Los geles 2-DE teñidos con Comassie revelaron entre 380-400 manchas protéicas (spots), situados entre 14 y 83 kDa y entre 5,4 y 7,7 pI. Se seleccionaron 22 proteínas para su identificación, mediante MALDI-TOF o ESI-Trampa iónica. Entre estas proteínas, se encontraron distintas formas de Malato deshidrogenasa (MDH) y Giceraldehido fosfato deshidrogenasa (GADPH). En el segundo trabajo de investigación, se realizó un estudio de proteómica de expresión diferencial, comparando el proteoma de dos cepas de B, cinerea con distinta vilurencia. Los extractos protéicos fueron analizados mediante 2-DE, revelándose diferencias cuantitativas y cualitativas entre los perfiles protéicos de ambas cepas.Se identificaron 27 sptos, 17 de los cuales fueron identificados como MDH, todos ellos específicos o sobreexpresados en la cepa más virulenta, lo que indicaría el posible papel de dichas enzimas en los procesos infectivos. La GADPH también es expresada de forma específica en la cepa más virulenta. Además, se identificaron otras proteínas de interés como la ciclofilina o el factor transcripcional metE/metH. La diferencia de expresión protéica entre cepas, podrían adscribirse a las diferencias de virulencia entre las cepas. Una de las aplicaciones de la proteómica es determinar aquellas proteínas sobre las que diseñar fungicidas de bajo impacto ambiental. En el tercer trabajo, se determinó la eficacia de 7 nueves fungicidas racionales contra dos especies de Phytophthora spp., para determinar la eficacia de estos compuestos y ampliar su espectro de actuación. En general, tods estos compuestos demostraron su actividad fungistática, con porcentajes de inhibición del crecimiento por encima del 45% a 100 ppm. Estos datos indicarían un buen coportamiento de estos compuestos a escala terapéutica.