Clonación, caracterización y expresión del gen pyrG de Penicillium chrysogenum AS-P-78estudio comparativo con otros genes homólogos

Resum

La clonacion del gen pyrg de penicillium chrysogenum as-p-78 se llevo a cabo mediante la hibridacion heterologa de una genoteca construida en el bacteriofago embl3, utilizando como sonda el gen pyr4 de neurospora crassa. Despues de cuatro rondas de hibridacion se aislaron 7 fagos recombinantes portadores del gen pyrg, que denominamos: 4a, 4b, 5, 6a, 6b, 11a y 11b. El adn de estos fagos fue capaz de complementar mutantes pyrg de penicillium, lo que demuestra que dichos fagos recombinantes son portadores del gen. El gen clonado codifica para la enzima oritidina-5-fosfato (omp) descarboxilasa (ec 4.1.1.23), enzima implicado en la biosintesis de pirimidinas, y es similar a los genes homologos de otros eucariotas inferiores: ura3 de saccharomyces cerevisiae, pyr4 de n. Crassa, pyrg de aspergillus nidulans y pyrg de a. Niger con los que mantiene una elevada homologia. El gen pyrg de penicillium fue capaz de complementar mutantes pyrg de a. Nidulans (plasmido puljm1), lo que demuestra la cercania evolutiva de estos dos hongos filamentosos, principalmente deducida del hecho de que aspergillus pueda procesar genes con intrones de penicillium. En cambio el gen pyrg no fue capaz de complementar mutantes pyrf de e. Coli, ni tampoco mutantes ura3 de s. Cerevisiae, posiblemente se deba a la presencia de un intron dentro del gen pyrg. El analisis de la secuencia del gen pyrg, 883 pb, revelo un orf de 275 aminoacidos y la presencia de un intron de 55 nucleotidos dentro del codon para arginina, en identica posicion que los otros genes pyrg de a. Nidulans y a. Niger, codificandose un polipeptido de 29781 g/mol de masa molecular. La homologia con los otros genes pyrg alcanzo niveles muy elevados: 68% con el de a. Nidulans y 74% con el de a. Niger, para la secuencia de nucleotidos y 73% y 84% para la de aminoacidos respectivamente.