Factores y mechanismos de toxicidad de las nanoparticulas metalicas

Resumen

Las nanopartículas (NPs), debido a la naturaleza de sus propiedades fisicoquímicas singulares, son objeto creciente de investigación, producción, desarrollo y aplicación en productos de consumo e industriales. El uso creciente de estas nanopartículas traerá consigo un incremento de su liberación a los compartimentos ambientales, entre ellos el medio marino, pudiendo afectar a los organismos que viven en él. Aunque son numerosos los beneficios del uso de las nanopartículas, también existe una preocupación creciente sobre el impacto que puedan tener, dada su capacidad para entrar en las células, orgánulos y núcleos, provocando –entre otros efectos- estrés oxidativo. El conocimiento acerca de los mecanismos moleculares y celulares, relacionados con la toxicidad de las nanopartículas, en organismos expuestos a éstas –como los invertebrados marinos- es muy limitado. En esta tesis doctoral se estudia la toxicidad potencial de nanopartículas de oro y cobre (Au NP y CuO NP, respectivamente) en un organism modelo, la almeja japonesa, Ruditapes philippinarum, mediante aproximaciones in vivo e in vitro. Mientras que estudios previos evidenciaron que las Au NPs pueden generar estrés oxidativo en organismos marinos a concentraciones elevadas, se desconocía el comportamiento y efecto a concnetraciones ambientalmente relevantes. Con el fin de profundizar los conocimientos sobre la distribución celular y los efectos de la exposición a las NPs seleccionadas, se realizaron una serie de experimentos de exposición in vivo para estudiar la absorción, eliminación y captación intracelular de las NPs, así como sus efectos en condiciones de exposición a corto plazo y concentraciones subcronicas ambientalmente relevantes (30, 6 y 0,75 µg L-1) de Au NPs citrato (~20 nm). Usando un enfoque de toxicología sistemática combinamos una investigación dirigida al estrés oxidativo producido y los eventos secuenciales que desencadene, usando marcadores bioquímicos y moleculares, con un enfoque proteómico -no dirigido de alto rendimiento- mediante la técnica iTRAQ. Nuestros resultados demuestran que en las concentraciones ensayadas, las partículas son fácilmente absorbidas en la glándula digestiva y branquias y se pueden producir cambios significativos (p<0.05) en el estrés oxidativo y en la respuesta inflamatoria, medidos a través de enzimas antioxidantes de fase II y análisis de expresión génica mediante q-PCR. Sin embargo, la magnitud total de respuestas era baja, y y no se detectó daño oxidativo. El enfoque proteómico por iTRAQ reafirmó aún más el potencial oxidativo de las partículas e identificó adicionalmente varias proteínas que forman parte de la cadena de reacción relacionado con el estrés oxidativo (ruta NF-kB). Además se observaron alteraciones sustanciales en las proteínas relacionadas con la organización del citoesqueleto y la diferenciación celular, así como en proteínas musculares. Adicionalmente, se observó una eliminación significativa de Au en el tracto digestivo en un plazo de purificación de 7 días, siendo la excreción una importante vía de eliminación. Actualmente, el conocimiento de los factores y mecanismos de (nano-) toxicidad provocada por nanoparticulas de CuO en invertebrados marinos es limitado. Por lo tanto, y con el fin de reducir la falta de conocimiento existente hemos realizado un estudio de las características y comportamiento de dos CuO NPs disponibles en el mercado que presentan un tamaño similar, pero con diferentes métodos de síntesis, bajo diferentes condiciones experimentales y ambientales. Además se estudiaron la viabilidad celular y daño en el ADN, así como la expresión de genes relacionados con la desintoxicación, el estrés oxidativo, la respuesta inflamatoria, la reparación de daño en el DNA y los marcadores mediadores de la muerte celular en cultivos primarios de hemocitos y, cuando procedía, se compararon con el comportamiento y los efectos producidos por CuO en estado de micropartículas y Cu iónico. Se verificó que los métodos de síntesis pueden influir en las características y el comportamiento de las partículas, y por lo tanto en la toxicidad de CuO NP en hemocitos de Ruditapes philippinarum. Nuestros resultados indican, además, que en las condiciones ensayadas, el comportamiento de agregación influye en la toxicidad de CuO NPs determinando su velocidad de disolución extra e intracelular. El análisis de expresión de genes identificó una regulación negativa similar para todos los tratamientos de cobre ensayados, lo que indica, además, que la toxicidad de nanopartículas de CuO y el material bulk pueden estar relacionados con mecanismos de toxicidad similares. Adicionalmente, nuestro trabajo identificó varias diferencias en la cinética de agregación y disolución de las partículas de CuO en el medio ambiente y en las condiciones de exposición en cultivos celulares, que es necesario tener en cuenta cuando se extrapolan los resultados de experimetnos in vitro.