Optimización de la expresión del gen "Chy", del procesamiento y de la secreción de quimosina bovina en "Aspergillus awamori"

Resum

Los problemas de suministro de cuajo animal y la expansión de la industria del queso forzaron la búsqueda de enzimas alternativas al cuajo animal. Además durante los últimos años la producción de proteínas heterólogas en hongos filamentosos ha sido drásticamente mejorada. Se realizó en nuestro laboratorio el diseño y síntesis del gen chy para la expresión en Aspergillus awamori. Para la obtención de quimosina recombinante utilizando el gen sintético se han construido casetes de expresión utilizando las señales de expresión de los genes amyB de Aspergillus oryzae y gla de Aspergillus niger. En las construcciones se utilizarón las señales líder fúngicas correspondientes a los promotores utilizados y a su vez se realizaron construcciones utilizando la señal pre propia del gen de la quimosina. Los transformantes obtenidos producen quimosina recombinante en cantidades aceptables, destacándose la producción de los transformantes que utilizan las señales de expresión del gen amyB de Aspergillus oryzae con una producción de 23 mg/L. El análisis del transcrito muestra que el gen se estaba transcribiendo correctamente y que posiblemente los limitantes en la producción se encontraban a nivel de secreción. El medio de producción utilizado para la obtención de quimosina recombinante fue el medio MDFA modificado, suplementado con 1% de caseína, se observó que con este medio se ve favorecida la producción. Se observó que utilizando los péptidos de la caseína como suplemento en el medio de producción de la quimosina recombinante se ve aumentado la secreción. Con la utilización de estrategias para la producción de proteínas heterólogas en hongos filamentosos como utilización del gen sintético, de señales de expresión fuertes y propias del hospedador o especies filogenéticamente cercanas, y optimización del medio de cultivo, se ha logrado obtener quimosina recombínate, observando que el factor limitante es el proceso de secreció