Aplicación de herramientas metabolómicas para el estudio del carácter pungente en cebolla

Resumen

Actualmente, tanto la sociedad en general, como los profesionales en el ámbito de la salud, están cada vez más interesados en identificar patrones dietéticos (alimentos funcionales y sus componentes) con la capacidad de mejorar la salud, concretamente con las propiedades de disminuir el riesgo de padecer diferentes enfermedades. En este sentido, los metabolitos secundarios del metabolismo vegetal son un grupo de sustancias producidas por las plantas para su propio crecimiento y reproducción, pero que también funcionan como compuestos bioactivos, presentando enormes beneficios para los consumidores por sus propiedades fisiológicas, de forma particular por su capacidad antioxidante. La cebolla (Allium cepa L.) es uno de los vegetales más cultivados y consumidos. Tradicionalmente sus aplicaciones se restringían a su uso en cocina debido a sus enormes propiedades culinarias. No obstante, en los últimos años ha aumentado su uso como remedio o preventivo para determinados trastornos de la salud. Diferentes artículos científicos han mostrado que el consumo de cebolla ayuda a reducir el riesgo de desarrollar diferentes enfermedades. Estos efectos fisiológicos están asociados en gran medida a su contenido en compuestos metabólicos, siendo por tanto importante conocer en detalle la cantidad y variedad de estos compuestos en diferentes tipos de cebolla. Principalmente, en la cebolla destacan dos familias de metabolitos, los compuestos azufrados y los compuestos fenólicos, los cuales presentan propiedades anticancerígenas, antinflamatorias o antioxidantes, entre otras. Los compuestos azufrados pueden alcanzar hasta el 5% del peso seco de la cebolla y son responsables de gran variedad de sus aromas y sabores, y especialmente de su pungencia. Los compuestos con azufre mayoritarios del bulbo de cebolla intacto son los sulfóxidos de cisteína (SCs). Cuando los tejidos de las cebollas son dañados se libera una enzima (alinasa) que da lugar a la hidrólisis de estos sulfóxidos y desencadenan una serie de reacciones que originan gran variedad de compuestos azufrados aromáticos. A pesar del interés que presentan estos compuestos, es habitual la cuantificación del ácido pirúvico que se genera en esta hidrólisis, como medida indirecta de la pungencia, dada la dificultad que presentan la determinación del resto de componentes de forma individualizada. Con respecto a los compuestos fenólicos, todos los tipos de cebollas presentan un alto contenido en flavonoles, específicamente en quercetina, siendo la cebolla la principal fuente de este compuesto en nuestra dieta. Los flavonoles no son los únicos compuestos fenólicos en la cebolla, las variedades rojas son también una fuente rica de antocianinas. Las antocianinas son unos pigmentos naturales responsables del color rojo del bulbo de cebolla. La cantidad y variedad de estos estos compuestos presentes en la cebolla depende de factores como la variedad, el suelo, el clima y las condiciones de cultivo. Es por ello por lo que la composición exacta de cebollas de distintos orígenes geográficos puede ser diferente, ayudando su caracterización y análisis en detalle a evaluar las propiedades beneficiosas de estas especies y su contribución sobre la mejora de la salud. Para ello, es fundamental contar con métodos de extracción y análisis óptimos que permitan extraer los compuestos de interés y analizarlos con fiabilidad. No obstante, ambas tareas se han visto a menudo dificultadas tanto por problemas inherentes a los cultivos como por la ausencia de metodologías asequibles y suficientemente optimizadas. Por este motivo, en la presente Tesis Doctoral se plantea como objetivo el desarrollo de metodologías analíticas rápidas y eficientes de extracción y análisis, es decir, un conjunto de herramientas metabolómicas que permitan determinar los compuestos con carácter bioactivo en cebolla. En adición a las técnicas tradicionales de extracción como la maceración o la agitación, en esta Tesis Doctoral se plantea el uso de nuevas tecnologías de extracción como la extracción asistida por ultrasonidos (UAE) o la extracción asistida por microondas (MAE), como técnicas de preparación de las muestras. Estas técnicas permiten un aporte efectivo de la energía en el proceso de extracción. Esto se traduce en rendimientos de extracción más altos en menores tiempos, también en un incremento de la fiabilidad de los resultados, al mejorar tanto la reproducibilidad como la robustez de los métodos, y además con un menor uso de disolventes, lo que representa un ahorro económico y las convierte en métodos de extracción "verdes". Para el estudio de los compuestos con azufre, se va a hacer uso de una técnica de preconcentración que combina la extracción y la inyección en un solo paso: la desorción térmica directa (DTD). La DTD permite desarrollar métodos analíticos para el estudio de compuestos volátiles mediante su acoplamiento con la cromatografía de gases (GC) y la espectrometría de masas (MS). Estos métodos presentas grandes ventajas como tiempos de extracción cortos, simplicidad de operación, naturaleza sin disolventes del proceso lo que la hace una alternativa más limpia y respetuosa con el medioambiente, alta sensibilidad, reproducibilidad y robustez. Además de las técnicas de extracción, es necesario disponer de métodos analíticos eficientes para determinar los compuestos fenólicos y azufrados extraídos de la cebolla con selectividad y sensibilidad. La cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) y la cromatografía líquida de ultra-alta eficacia (UHPLC) con detección mediante UV-Vis, se han empleado en el análisis de los compuestos fenólicos y la GC combinada con la MS en el análisis de los compuestos azufrados. Todas estas técnicas han permitido llevar a cabo análisis fiables con buena resolución y tiempos cortos de análisis. Todas las técnicas analíticas propuestas en esta Tesis Doctoral presentan grandes ventajas, sin embargo, ha sido necesario optimizar los diferentes factores que pueden afectar a cada uno de los procesos, así como evaluar los parámetros analíticos que describen la calidad de los resultados (repetibilidad, precisión intermedia o límites de detección (LOD) entre otros). Para estas optimizaciones se ha hecho uso de los diseños de experimentos (DOEs). Concretamente, se ha empleado el diseño de Box-Behnken (BBD) combinado con la metodología de superficie de respuesta (RSM). Empleando esta herramienta se puede estudiar tanto el efecto individual como combinado de los factores sobre cada una de las variables de respuesta: composición de flavonoles, composición de antocianinas, composición de compuestos fenólicos totales, actividad antioxidante de los extractos de cebolla y composición de compuestos azufrados. En base a los resultados obtenidos en la presente Tesis Doctoral, las herramientas metabolómicas elaboradas, es decir, los distintos métodos de extracción y análisis desarrollados centrados en los metabolitos secundarios con actividad biológica de las cebollas han resultado precisos, reproducibles, económicos y rápidos y han producido excelentes resultados en los análisis de los compuestos de interés en la matriz vegetal de cebolla estudiada. Se trata por tanto de metodologías analíticas adecuadas para el control y el estudio de los compuestos asociados con el carácter pungente en cebollas, así como de los compuestos fenólicos, todos ellos con interesantes propiedades beneficiosas para la salud de los consumidores y relacionadas con la calidad sensorial de la matriz vegetal. Por tanto, de cara al futuro, estas metodologías analíticas permitirán evaluar la calidad de distintos tipos de cebollas y conseguir una mejor selección del producto final gracias a su caracterización. Las investigaciones realizadas en esta Tesis Doctoral han dado lugar hasta el momento a cinco artículos científicos, todos ellos publicados en revistas de alta calidad indexadas en el primer cuartil en base a Journal Citation Report. Dichos artículos se recopilan en la Sección 5 de esta memoria que se presenta bajo la modalidad de compendio de publicaciones (reglamento UCA/CG06/2012 del 27 de junio de 2012, por el que se regula la ordenación de los estudios de doctorado en la Universidad de Cádiz.). Además, esta memoria se presenta también bajo la modalidad de Doctorado Internacional con Mención Internacional, por lo que, siguiendo los requisitos establecidos en el Artículo 34 del Reglamento UCA/CG06/2012 del 27 de junio de 2012 por el que se regula la ordenación de los estudios de doctorado en la Universidad de Cádiz, el resumen ¿summary¿ (Sección 2), parte de los resultados (Sección 5) y las conclusiones (Sección 7) se han redactado en inglés.